RBMX2在M. bovis感染细胞中的表达分析
验证RBMX2在M. bovis感染后的表达变化，并确定其作为宿主因子的相关性。
用M. bovis感染EBL、BoMac、牛肺泡原代细胞和人A549细胞，通过RT-qPCR和Western blot检测RBMX2 mRNA和蛋白水平。
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RBMX2将牛分枝杆菌感染与上皮-间质转化及肺癌进展联系起来。
RBMX2 links Mycobacterium bovis infection to epithelial-mesenchymal transition and lung cancer progression.
实验完整度
高包含CRISPR/Cas9基因敲除、多组学分析、细胞功能实验（粘附、侵袭、Transwell）、动物模型及临床组织验证等多层次证据，并进行通路激活剂和siRNA机制验证。
主要模型
EBL细胞 BoMac细胞 H1299细胞 A549细胞 牛肺泡原代细胞
重点核对
RBMX2在牛分枝杆菌感染后mRNA和蛋白表达上调 RBMX2敲除增强紧密连接蛋白表达并减少细胞粘附 p65激活剂PMA对紧密连接和EMT标志物的影响 p65 siRNA敲低对MMP-9和M. bovis侵袭的影响 临床肺腺癌和鳞癌组织中RBMX2表达升高
摘要
结核病（TB）是一种由病原体、宿主和环境因素相互作用引起的复杂疾病。2022年，结核病影响全球1060万人，并导致130万人死亡。在人类结核病高负担的人畜共患结核病地区，牛分枝杆菌约占人类结核病病例的10%。结核分枝杆菌的免疫逃逸和潜伏性阻碍了对宿主反应的理解。在此，我们确定RNA结合基序蛋白X连锁2（RBMX2）是促进牛分枝杆菌感染的新型宿主因子。RBMX2表达在多种细胞类型中显著上调，包括EBL、BoMac、牛肺泡原代细胞和人A549细胞。多组学分析、细胞粘附实验和ChIP-PCR表明，RBMX2通过p65信号传导抑制细胞粘附和紧密连接，同时增强牛分枝杆菌的粘附和入侵。整合的转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据揭示，RBMX2调节上皮-间质转化（EMT），这一过程与癌症进展相关。TIMER2.0分析显示RBMX2在肺腺癌和肺鳞状细胞癌组织中表达升高，并通过免疫荧光验证。使用牛分枝杆菌诱导的BoMac-EBL EMT模型和H1299细胞，我们表明RBMX2通过p65/MMP-9通路激活促进EMT。总的来说，RBMX2是一种新型宿主因子，可增强牛分枝杆菌感染并驱动感染诱导的EMT。这些发现为结核病发病机制提供了新的见解，并强调RBMX2是结核病疫苗和治疗开发的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探究宿主因子RBMX2在M. bovis感染及感染相关上皮-间质转化（EMT）中的分子机制，以及其与肺癌进展的潜在联系。
- 核心机制
- RBMX2通过促进p65蛋白的磷酸化和核转位，下调紧密连接蛋白并激活p65/MMP-9信号通路，从而促进M. bovis感染和EMT。
- 主要证据
- 基于CRISPR/Cas9敲除细胞、多组学分析、细胞粘附与侵袭实验、Transwell迁移实验、双荧光素酶报告基因和ChIP-PCR等验证，证明RBMX2通过p65/MMP-9通路发挥作用。
- 研究意义
- 作者提出RBMX2作为结核病和结核相关恶性肿瘤的潜在治疗靶点，靶向RBMX2可能为预防和治疗人类及动物结核病提供新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RBMX2敲除对细胞存活和周期的影响
评估RBMX2敲除对细胞增殖和凋亡的影响，以及其对M. bovis感染的抵抗力。
通过CRISPR/Cas9生成RBMX2敲除EBL细胞，使用流式细胞术检测细胞周期，CCK-8和结晶紫染色评估细胞存活。
转录组和蛋白质组学分析
鉴定RBMX2调控的下游基因和通路，特别是与细胞紧密连接和EMT相关的通路。
对RBMX2敲除和野生型EBL细胞在M. bovis感染后0、24、48小时进行RNA-seq，并在48小时进行蛋白质组学分析；通过GO和KEGG通路富集分析。
RBMX2对紧密连接完整性的影响
验证RBMX2是否通过破坏紧密连接影响上皮屏障功能。
用M. bovis感染RBMX2敲除和野生型EBL细胞，检测紧密连接相关基因和蛋白表达（TJP1, OCLN, CLDN-5等），进行细胞粘附实验，并检测炎症因子表达。
RBMX2调控p65信号通路
阐明RBMX2通过p65信号通路调控紧密连接的机制。
检测MAPK通路和p65磷酸化水平；用p65、p38和JNK激活剂处理RBMX2敲除细胞，观察紧密连接蛋白和粘附变化；用siRNA敲低p65，检测其对紧密连接和M. bovis侵袭的影响；通过Western blot和活细胞成像检测p65核转位。
RBMX2对细菌粘附、侵袭和胞内生存的影响
探究RBMX2是否通过破坏紧密连接促进M. bovis及其他病原体的粘附、侵袭和胞内生存。
将RBMX2敲除和野生型EBL细胞以MOI 20感染M. bovis，在不同时间点通过平板计数测定细菌粘附、侵袭和胞内生存；也测试了BCG、M. smegmatis、沙门氏菌和大肠杆菌。
RBMX2在肺癌组织和细胞中的表达分析
评估RBMX2在肺癌中的表达水平及其与癌症进展的潜在关联。
使用TIMER2.0分析TCGA数据库中RBMX2在泛癌中的表达；通过RT-qPCR检测肺癌细胞系和正常肺上皮细胞中RBMX2表达；通过免疫荧光检测肺癌临床组织中的RBMX2表达。
代谢组学分析
探索RBMX2敲除后代谢途径的变化，及其与肿瘤代谢和EMT的关联。
对RBMX2敲除和野生型EBL细胞在M. bovis感染后48小时进行代谢组学分析，鉴定差异代谢物和富集途径。
RBMX2对EMT过程的影响
验证RBMX2是否促进M. bovis感染诱导的EMT。
构建M. bovis感染的BoMac细胞与EBL细胞共培养模型，检测EMT标志物（E-cadherin, N-cadherin, MMP-9）表达、细胞形态变化、迁移和侵袭能力；并在RBMX2敲除细胞中验证。
RBMX2通过p65/MMP-9通路促进EMT
阐明RBMX2调控EMT的具体分子通路。
在共培养模型中，用p65、p38和JNK激活剂处理RBMX2敲除细胞，检测EMT标志物和细胞迁移；用siRNA敲低p65，检测MMP-9表达；通过分子对接、双荧光素酶报告实验和ChIP-PCR验证p65与RBMX2及MMP-9启动子结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 达尔伯克改良伊格尔培养基 | Gibco | -- |
| 罗斯威尔帕克纪念研究所1640培养基 | Gibco | -- | |
| 细菌培养 | Middlebrook 7H9肉汤 | BD | -- |
| Middlebrook 7H11琼脂 | BD | -- | |
| OADC增菌液 | BD | -- | |
| 吐温80 | Sigma | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| DEPC处理水 | -- | -- | |
| NanoDrop ND-1000分光光度计 | Agilent Inc | -- | |
| RT-qPCR | HiScript III RT SuperMix 用于qPCR（含gDNA去除剂） | Vazyme | -- |
| AceQ qPCR SYBR Green预混液 | Vazyme | -- | |
| ViiA7实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems Inc | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ZO-1一抗 | Bioss | -- | |
| OCLN一抗 | Proteintech | -- | |
| CLDN-5一抗 | Proteintech | -- | |
| MMP-9一抗 | Proteintech | -- | |
| E-cadherin一抗 | Proteintech | -- | |
| N-cadherin一抗 | Bioss | -- | |
| LaminA/C一抗 | Proteintech | -- | |
| β-actin一抗 | Bioss | -- | |
| p65一抗 | CST | -- | |
| p-p65一抗 | CST | -- | |
| MAPK相关抗体 | CST | -- | |
| 抗小鼠HRP二抗 | Invitrogen | -- | |
| 抗兔HRP二抗 | Invitrogen | -- | |
| 细胞粘附实验 | 基质胶 | -- | -- |
| 细胞粘附检测试剂盒 | Bestbio | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 细胞迁移/侵袭实验 | 结晶紫溶液 | Beyotime | -- |
| 流式细胞术 | 细胞周期与凋亡分析试剂盒 | Beyotime | -- |
| 细胞活力测定 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| siRNA转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- |
| p65 siRNA | Tsingke | -- | |
| ChIP-PCR | 蛋白A+G琼脂糖/鲑鱼精DNA | -- | -- |
| 双荧光素酶报告实验 | pGL4.10载体 | Promega | -- |
| pRL TK载体 | Promega | -- | |
| 双荧光素酶检测试剂 | Promega | -- | |
| RNA-seq | AMPure XP纯化磁珠系统 | Beckman Coulter | -- |
| Agilent高灵敏度DNA分析 | Agilent | -- | |
| NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | EBL和BoMac细胞的培养条件，包括培养基、血清浓度、温度和CO2浓度。 阅读提示：Methods - Cell lines |
| 细菌培养 | M. bovis, BCG, M. smegmatis, E. coli, Salmonella菌株的培养基和生长条件。 阅读提示：Methods - Bacterium |
| RBMX2敲除 | sgRNA靶向序列、慢病毒载体、嘌呤霉素筛选浓度、单克隆筛选方法。 阅读提示：Methods - Generation of the RBMX2-KO EBL cells |
| 感染实验 | 感染复数（MOI）、感染时间、温度、是否使用庆大霉素清除胞外菌及其浓度和时间。 阅读提示：Methods - Adhesion assay, Invasion assay, Intracellular survival assay |
| RNA-seq和蛋白质组学 | 感染后时间点（0、24、48小时）、MOI、样品处理、测序平台、差异基因筛选标准。 阅读提示：Methods - RNA-seq, proteomics, and metabolomics |
| 通路激活剂处理 | PMA、Anisomycin、ML141的浓度和处理时间。 阅读提示：Results - RBMX2 disrupted the epithelial barrier via activating p65 |
| siRNA转染 | p65 siRNA序列、转染试剂、转染时间。 阅读提示：Methods - siRNA transfection |
| 共培养模型 | BoMac细胞感染M. bovis的MOI和时间、清洗、庆大霉素处理、EBL细胞与BoMac细胞的共培养时间和条件。 阅读提示：Methods - M. bovis infection of BoMac and coculture with EBL cells |
| 双荧光素酶报告实验 | 转染的质粒组合、细胞密度、转染试剂、检测时间。 阅读提示：Methods - Dual-luciferase reporter assay |
| ChIP-PCR | 甲醛交联浓度和时间、超声破碎条件、抗体、洗涤步骤。 阅读提示：Methods - ChIP-PCR |