转录因子FOXC2通过环状RNA 0002898调控miR-145/ADAMTS5轴抑制肝细胞癌中的血管生成

Transcription factor FOXC2 regulates miR-145/ADAMTS5 axis to inhibit angiogenesis in hepatocellular carcinoma via circular RNA 0002898.

作者信息Jiangbei Yuan, Zixiang Pan, Fei Lv, Yue Zhao, Wei Zheng, Qiaoqiao Yin, LanJie Wu, Jianli Yu, Cheng'an Xu, Qiang He, Hongying Pan

PMID41291552

期刊BMC Cancer

发布时间2025-11

DOI10.1186/s12885-025-15171-z

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实验完整度

高

研究包含体外细胞功能实验（增殖、迁移、侵袭、集落形成）、体内裸鼠移植瘤模型、机制验证（ChIP、RIP、RNA pull-down、双荧光素酶报告基因）及临床样本分析，具有多个独立证据层级。

主要模型

HCC细胞系（Hep3B、Huh7等）正常肝细胞系HL-7702 HUVEC内皮细胞 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 80例HCC患者肿瘤及癌旁组织

重点核对

在HCC细胞系和临床样本中验证circ0002898的表达差异和临床相关性验证FOXC2对circ0002898的直接转录调控（ChIP和双荧光素酶报告基因）确认circ0002898与miR-145的相互作用（RIP、RNA pull-down和双荧光素酶报告基因）验证miR-145对ADAMTS5的直接靶向调控（双荧光素酶报告基因和表达分析）在体外和体内验证FOXC2/circ0002898/miR-145/ADAMTS5轴的抗肿瘤和抗血管生成功能

摘要

背景：环状RNA（circRNAs）是一类新型的单链共价闭合的非编码RNA分子，在过去的十年中，它们在细胞景观中的作用日益受到认可。这些分子主要定位于真核细胞的细胞质中，并已涉及多种癌症的发病机制。尽管如此，circRNAs在肝细胞癌（HCC）中的具体贡献尚未完全阐明。方法：我们的研究发现环状RNA0002898在HCC中下调，其表达降低与肿瘤分级进展和患者生存率降低相关。此外，我们证明了转录因子叉头框蛋白C2（FOXC2）调控环状RNA0002898的表达，而HCC中环状RNA0002898水平的降低与体外肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力增强相关。机制研究表明，环状RNA0002898通过拮抗miR-145调节肿瘤抑制因子含血小板反应蛋白基序的去整合素金属蛋白酶5（ADAMTS5）的表达水平，从而抑制血管生成并抑制HCC细胞的生长。结果：我们的发现共同阐明了环状RNA0002898在HCC中的调控作用、功能意义和潜在机制，这一关系此前未被探索。环状RNA0002898在HCC中的潜在预后意义及其作为治疗靶点的潜力值得进一步研究。

临床样本中circ0002898的表达及临床相关性分析

检测circ0002898在HCC组织与配对癌旁组织中的表达差异，并评估其与临床病理特征和预后的关系。

利用qRT-PCR检测80例HCC及癌旁组织中circ0002898表达，并采用RNA原位杂交（RNA-ISH）评估组织表达，分析其与肿瘤分级、Gleason评分及生存期的相关性，通过ROC曲线评估诊断价值。

circ0002898的特征鉴定及FOXC2调控验证

验证circ0002898的环状结构及其受转录因子FOXC2的转录调控。

通过Sanger测序验证circ0002898的剪接位点；RNase R和放线菌素D处理验证其稳定性；核质分离验证其定位。通过双荧光素酶报告基因和ChIP实验验证FOXC2与circ0002898启动子的结合及调控。

circ0002898对HCC细胞体外功能影响的验证

研究circ0002898对HCC细胞增殖、迁移、侵袭和集落形成能力的影响。

在Hep3B和Huh7细胞中敲低或过表达circ0002898，通过CCK-8、划痕实验、Transwell、集落形成实验检测细胞增殖、迁移、侵袭和无限增殖能力。

circ0002898体内抗肿瘤功能验证

在裸鼠异种移植模型中验证circ0002898对肿瘤生长和生存期的影响。

将稳定敲低或过表达circ0002898的Hep3B和Huh7细胞皮下植入裸鼠，定期测量肿瘤体积，最终测量肿瘤重量，并记录生存期。通过免疫组化检测CD31和Ki67表达。

circ0002898与miR-145的相互作用验证

验证circ0002898作为miR-145的分子海绵并调控其表达。

RNA免疫沉淀（RIP）和RNA pull-down实验验证circ0002898与miR-145的结合；双荧光素酶报告基因确认结合位点；qRT-PCR检测circ0002898对miR-145表达的影响。

miR-145对HCC细胞功能的影响

研究miR-145对HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。

在Hep3B和Huh7细胞中转染miR-145 mimics或inhibitors，通过CCK-8、划痕实验、Transwell、集落形成实验检测细胞功能。

miR-145靶基因ADAMTS5的验证

验证ADAMTS5是否为miR-145的直接靶基因。

通过TargetScan预测miR-145靶基因，qRT-PCR和Western blot检测miR-145对候选基因表达的影响；构建ADAMTS5 3'UTR WT和Mut双荧光素酶报告基因载体，验证直接相互作用。

circ0002898/miR-145/ADAMTS5轴的拯救实验验证

验证circ0002898通过miR-145/ADAMTS5轴发挥功能。

在circ0002898敲低或miR-145 mimics处理的细胞中，分别加入miR-145抑制剂或共表达ADAMTS5，检测细胞增殖、迁移、侵袭和集落形成能力的变化，以确认功能依赖于该轴。

ADAMTS5抗血管生成功能验证

验证ADAMTS5在体外对肿瘤血管生成的抑制作用及分子机制。

过表达ADAMTS5的Hep3B和Huh7细胞条件培养基处理HUVEC细胞，观察管形成、增殖和凋亡的变化；加入重组VEGF或Z-VAD-FMK验证机制。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	RPMI 1640培养基	Gibco	11875093
胎牛血清	Gibco	10100147
青霉素-链霉素	Beyotime	C0222
DMEM培养基	Biological Industries	01-055-1A
HUVEC专用培养基	Pricella	CM-0122
载体构建	pcDNA3.1载体	Tsingke Biotechnology	--
QuikChange定点突变试剂盒	Agilent	200519
细胞系构建	pLKO.1质粒	--	--
pLV-circ-puro质粒	--	--
FUGW质粒	--	--
Lipofectamine 3000转染试剂	Invitrogen	L3000015
聚合酶链反应	PCR预混液	Thermo	K0171
RNA提取与逆转录	RNA提取试剂盒	Promega	LS1040
SuperScript III第一链合成系统	Thermo	18080051
qRT-PCR	AceQ qPCR SYBR Green预混液	Vazyme	Q111-02
细胞增殖实验	CCK-8试剂盒	Beyotime	C0038
细胞染色	磷酸盐缓冲液	Beyotime	C0221A
结晶紫溶液	Beyotime	C0121-100mL
细胞迁移和侵袭实验	Transwell小室	SPL Life Sciences	36224
Matrigel基质胶	BD	356234
ChIP实验	ChIP试剂盒	Bersin Bio	Bes5001
抗FOXC2抗体	Abcam	ab5060
RIP实验	Magna RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒	Sigma	17-700
AGO2抗体	CST	2897
IgG抗体	CST	2729S
RNA pull-down实验	生物素化RNA pull-down试剂盒	Beyotime	P0654S
TRIzol试剂	Invitrogen	15596026
双荧光素酶报告基因实验	双荧光素酶报告基因检测系统	Promega	E1910
RNA原位杂交	RNA原位杂交试剂盒	Boster	MK11303
内皮细胞管形成实验	VEGF蛋白	Abcam	ab259412
EVOS M5000显微镜	Thermo	--
凋亡实验	Z-VAD-FMK	Sigma	627610
细胞凋亡ELISA检测试剂盒	Roche	11544675001
统计学分析	GraphPad Prism 9	GraphPad Software	--

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

RPMI 1640培养基

Gibco

11875093

胎牛血清

Gibco

10100147

青霉素-链霉素

Beyotime

C0222

DMEM培养基

Biological Industries

01-055-1A

HUVEC专用培养基

Pricella

CM-0122

载体构建

pcDNA3.1载体

Tsingke Biotechnology

QuikChange定点突变试剂盒

Agilent

200519

细胞系构建

pLKO.1质粒

pLV-circ-puro质粒

FUGW质粒

Lipofectamine 3000转染试剂

Invitrogen

L3000015

聚合酶链反应

PCR预混液

Thermo

K0171

RNA提取与逆转录

RNA提取试剂盒

Promega

LS1040

SuperScript III第一链合成系统

Thermo

18080051

qRT-PCR

AceQ qPCR SYBR Green预混液

Vazyme

Q111-02

细胞增殖实验

CCK-8试剂盒

Beyotime

C0038

细胞染色

磷酸盐缓冲液

Beyotime

C0221A

结晶紫溶液

Beyotime

C0121-100mL

细胞迁移和侵袭实验

Transwell小室

SPL Life Sciences

36224

Matrigel基质胶

356234

ChIP实验

ChIP试剂盒

Bersin Bio

Bes5001

抗FOXC2抗体

Abcam

ab5060

RIP实验

Magna RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒

Sigma

17-700

AGO2抗体

CST

2897

IgG抗体

CST

2729S

RNA pull-down实验

生物素化RNA pull-down试剂盒

Beyotime

P0654S

TRIzol试剂

Invitrogen

15596026

双荧光素酶报告基因实验

双荧光素酶报告基因检测系统

Promega

E1910

RNA原位杂交

RNA原位杂交试剂盒

Boster

MK11303

内皮细胞管形成实验

VEGF蛋白

Abcam

ab259412

EVOS M5000显微镜

Thermo

凋亡实验

Z-VAD-FMK

Sigma

627610

细胞凋亡ELISA检测试剂盒

Roche

11544675001

统计学分析

GraphPad Prism 9

GraphPad Software

环节	核对要点
临床样本分析	HCC和癌旁组织样本数量（n=80），样本来源（手术切除或活检），患者纳入和排除标准，circ0002898表达检测方法（qRT-PCR和RNA-ISH），临床分期和Gleason评分，生存数据收集和随访时间。阅读提示：Materials and methods: Clinical material and patient inclusion criteria; Results: 图1及相关描述。
细胞培养	细胞系名称（HL-7702, SNU-182, SNU-449, PLC/PRF/5, MHCC97H, HepG2, Hep3B, Huh7, HUVEC），培养基类型和添加成分（血清浓度、青链霉素），培养条件（37°C, 5% CO2）。阅读提示：Materials and methods: Cell culture。
载体构建和细胞系建立	过表达和敲低载体（pcDNA3.1, pLKO.1, pLV-circ-puro, FUGW），shRNA序列（Supplementary Table 1），转染试剂（Lipofectamine 3000）及用量，病毒包装细胞（293T），病毒收集时间。阅读提示：Materials and methods: Construction of vectors, Construction of cell lines; Supplementary Table 1。
体外功能实验	增殖实验细胞接种密度（1×10^4/孔），Transwell实验细胞数（迁移2×10^5，侵袭3×10^5），依赖Matrigel与否，培养时间（迁移36h，侵袭48h），集落形成实验接种细胞数（1000/孔）和培养时间（13天），划痕实验细节。阅读提示：Materials and methods: Cell proliferation assay, Colony formation assay, Cell migration and invasion assays; Results: 图3。
体内动物实验	动物品系（BALB/c nude mice），性别和年龄（6周龄雄性），细胞接种数量（2×10^6），接种部位（皮下），肿瘤体积测量时间点，实验终点（体积超过2000 mm3），每组动物数（n=8），生存分析。阅读提示：Materials and methods: In vivo tumor growth assays; Results: 图3。
机制研究	ChIP实验所用抗体（anti-FOXC2, ab5060），RIP实验所用抗体（AGO2, IgG），双荧光素酶报告基因构建（WT和Mut序列），RNA pull-down探针设计（生物素标记），miR-145 mimics和inhibitors浓度及处理时间。阅读提示：Materials and methods: Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay, RNA binding protein Immunoprecipitation (RIP) assay, Biotin-coupled probe pull-down assay, Dual-luciferase reporter assay; 图2, 图4, 图5。
血管生成实验	HUVEC细胞培养条件，条件培养基浓度（100%, 50%, 25%），VEGF浓度（20 ng/mL），管形成实验细胞数（4×10^4）和培养时间（12h），凋亡实验细胞数（1×10^4）和培养时间（24h），Z-VAD-FMK使用浓度和处理时间。阅读提示：Materials and methods: Endothelial cells tube formation assay, Apoptosis assay; 图7。
数据分析与统计	统计方法（Student's t-test, one-way/two-way ANOVA, chi-square test, Pearson's correlation, ROC曲线, Kaplan-Meier），多重比较校正方法（Tukey-Kramer），显著性水平（p<0.05），数据呈现（mean±SD）。阅读提示：Materials and methods: Statistical analysis。

环节

核对要点

临床样本分析

HCC和癌旁组织样本数量（n=80），样本来源（手术切除或活检），患者纳入和排除标准，circ0002898表达检测方法（qRT-PCR和RNA-ISH），临床分期和Gleason评分，生存数据收集和随访时间。

阅读提示：Materials and methods: Clinical material and patient inclusion criteria; Results: 图1及相关描述。

细胞培养

细胞系名称（HL-7702, SNU-182, SNU-449, PLC/PRF/5, MHCC97H, HepG2, Hep3B, Huh7, HUVEC），培养基类型和添加成分（血清浓度、青链霉素），培养条件（37°C, 5% CO2）。

阅读提示：Materials and methods: Cell culture。

载体构建和细胞系建立

过表达和敲低载体（pcDNA3.1, pLKO.1, pLV-circ-puro, FUGW），shRNA序列（Supplementary Table 1），转染试剂（Lipofectamine 3000）及用量，病毒包装细胞（293T），病毒收集时间。

阅读提示：Materials and methods: Construction of vectors, Construction of cell lines; Supplementary Table 1。

体外功能实验

增殖实验细胞接种密度（1×10^4/孔），Transwell实验细胞数（迁移2×10^5，侵袭3×10^5），依赖Matrigel与否，培养时间（迁移36h，侵袭48h），集落形成实验接种细胞数（1000/孔）和培养时间（13天），划痕实验细节。

阅读提示：Materials and methods: Cell proliferation assay, Colony formation assay, Cell migration and invasion assays; Results: 图3。

体内动物实验

动物品系（BALB/c nude mice），性别和年龄（6周龄雄性），细胞接种数量（2×10^6），接种部位（皮下），肿瘤体积测量时间点，实验终点（体积超过2000 mm3），每组动物数（n=8），生存分析。

阅读提示：Materials and methods: In vivo tumor growth assays; Results: 图3。

机制研究

ChIP实验所用抗体（anti-FOXC2, ab5060），RIP实验所用抗体（AGO2, IgG），双荧光素酶报告基因构建（WT和Mut序列），RNA pull-down探针设计（生物素标记），miR-145 mimics和inhibitors浓度及处理时间。

阅读提示：Materials and methods: Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay, RNA binding protein Immunoprecipitation (RIP) assay, Biotin-coupled probe pull-down assay, Dual-luciferase reporter assay; 图2, 图4, 图5。

血管生成实验

HUVEC细胞培养条件，条件培养基浓度（100%, 50%, 25%），VEGF浓度（20 ng/mL），管形成实验细胞数（4×10^4）和培养时间（12h），凋亡实验细胞数（1×10^4）和培养时间（24h），Z-VAD-FMK使用浓度和处理时间。

阅读提示：Materials and methods: Endothelial cells tube formation assay, Apoptosis assay; 图7。

数据分析与统计

统计方法（Student's t-test, one-way/two-way ANOVA, chi-square test, Pearson's correlation, ROC曲线, Kaplan-Meier），多重比较校正方法（Tukey-Kramer），显著性水平（p<0.05），数据呈现（mean±SD）。

阅读提示：Materials and methods: Statistical analysis。

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