生物信息学分析
评估YAP1-TEAD及其下游靶基因在OSCC中的表达和预后相关性。
从TCGA数据库提取HNSC数据，筛选OSCC样本，使用R4.3.2分析配对肿瘤和癌旁正常组织的RNA-Seq FPKM数据，进行配对样本t检验和Kaplan-Meier生存分析。
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靶向YAP1-TEAD相互作用的肽类干扰物在口腔癌中的设计与生物学评估
Design and biological evaluation of peptide disruptors targeting YAP1-TEAD interaction for oral cancer.
实验完整度
高包含计算模拟（残基扫描、MD）、体外结合实验（SPR）、细胞增殖、迁移和侵袭功能验证，多个独立证据层级。
主要模型
SCC25细胞系 HN30细胞系 TCGA HNSC数据集中的OSCC样本
重点核对
TEAD蛋白纯化使用BL21(DE3) Competent cells，Ni²⁺-NTA beads和分子筛层析 肽段纯度通过RP-HPLC和LC-MS鉴定，纯度>90% SPR实验将TEAD固定于CMS芯片，使用Biacore 8K系统 OSCC细胞系SCC25和HN30来源与培养条件 细胞实验中的干扰物浓度（如200 µM）和处理时间（48小时，24小时）
摘要
背景：先前的研究强调了Yes相关蛋白1-TEA结构域转录因子（YAP1-TEAD）相互作用在口腔癌进展中的关键作用。然而，仍然缺乏直接靶向YAP1-TEAD蛋白相互作用的干扰物，以及对其在口腔癌中作用的详细研究。因此，我们旨在通过计算方法合理设计肽类YAP1-TEAD蛋白相互作用干扰物，并探讨直接破坏YAP1-TEAD相互作用对口腔鳞状细胞癌（OSCC）的影响。方法：采用基于肽的计算残基扫描，通过分析突变对结合亲和力和稳定性的影响来设计YAP1-TEAD相互作用的肽类干扰物。进行了分子动力学（MD）模拟以从动态角度评估结合亲和力和稳定性。使用表面等离子体共振（SPR）分析评估体外结合亲和力。经过三轮迭代优化，将该系列中亲和力最高的两种干扰物应用于OSCC细胞系，以研究直接破坏YAP1-TEAD相互作用的主要效应。结果：与配对的正常组织相比，OSCC组织中YAP1、TEADs及四个下游转录靶标的表达显著升高。使用计算残基扫描、MD模拟和SPR分析对YAP1-TEAD干扰物进行了设计和评估。经过三轮优化，YTPD9和YTPD11显示出最高的亲和力，其结合亲和力是野生型YAP1的10倍以上。当应用于OSCC细胞系时，这些干扰物对细胞增殖的影响有限，但能有效抑制迁移和侵袭能力。结论：本研究通过计算模拟和体外实验开发了一系列靶向YAP1-TEAD蛋白相互作用的肽类干扰物。在OSCC中对其中两种干扰物的生物学评估证实，直接破坏YAP1-TEAD主要影响口腔癌的迁移和侵袭能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 直接破坏YAP1-TEAD相互作用对口腔鳞状细胞癌（OSCC）进展的影响是什么？
- 核心机制
- YAP1-TEAD相互作用主要通过促进细胞迁移和侵袭，而非增殖，来影响OSCC进展。
- 主要证据
- 基于TCGA数据库分析显示YAP1-TEAD及其下游靶基因在OSCC中高表达；通过计算模拟和SPR实验设计优化肽类干扰物，验证了高亲和力；细胞实验表明干扰物抑制迁移和侵袭。
- 研究意义
- 本研究开发的靶向YAP1-TEAD的肽类干扰物为OSCC治疗提供了新的潜在靶点，并可作为无脱靶效应的研究工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肽类干扰物设计
通过计算残基扫描设计高亲和力的YAP1-TEAD肽类干扰物。
从PDB获取YAP1-TEAD复合物结构（6GE3），使用Schrödinger的蛋白质准备流程优化，对YAP1的84-100残基进行饱和突变扫描，计算结合亲和力和稳定性。
蛋白表达与纯化
获得重组TEAD蛋白用于SPR实验。
使用BL21(DE3)感受态细胞表达TEAD，通过高压细胞裂解、Ni²⁺-NTA和分子筛层析纯化。
SPR结合实验
测定肽类干扰物与TEAD的结合亲和力。
将纯化的TEAD固定于CM5芯片，使用Biacore 8K系统测定肽段结合亲和力。
分子动力学模拟
评估突变肽与TEAD结合的动态稳定性和能量。
使用Desmond包对肽-TEAD复合物进行MD模拟，计算iRMSD和MMGBSA结合自由能，并进行自由能分解。
细胞增殖实验
评估干扰物对OSCC细胞增殖的影响。
使用CCK-8实验检测SCC25和HN30细胞在干扰物处理后的活力，细胞在无血清培养基中饥饿12小时，随后用含干扰物或DMSO的完全培养基处理48小时，然后加入CCK8试剂孵育1小时，记录450nm OD值。
细胞迁移实验
评估干扰物对OSCC细胞迁移能力的影响。
使用划痕实验检测SCC25和HN30细胞迁移，细胞饥饿12小时后划痕，加入干扰物或DMSO培养24小时，通过显微镜拍摄记录迁移面积。
细胞侵袭实验
评估干扰物对OSCC细胞侵袭能力的影响。
使用Transwell实验检测HN30细胞侵袭，细胞饥饿12小时，接种于包被Matrigel的上室，加入干扰物或DMSO，下室含20% FBS培养基，培养24小时后固定、结晶紫染色，显微镜观察侵袭细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证结合亲和力
验证机制链路
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白克隆、表达和纯化 | BL21(DE3)感受态细胞 | -- | -- |
| 蛋白纯化 | Ni²⁺-NTA 琼脂糖珠 | -- | -- |
| 肽段合成 | YAP1-TEAD干扰物和野生型YAP1（残基84-100） | GenScript (China) | -- |
| 肽段纯度鉴定 | 反相高效液相色谱 | -- | -- |
| 液相色谱-质谱联用 | -- | -- | |
| SPR分析 | Biacore™ 8K 表面等离子体共振系统 | Cytiva (Sweden) | -- |
| Series S 传感器 CM5 芯片 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Meilunbio (China) | -- |
| DMEM培养基 | Meilunbio (China) | -- | |
| 胎牛血清 | Every Green (China) | -- | |
| 青霉素 | Gibco (USA) | -- | |
| 链霉素 | Gibco (USA) | -- | |
| 细胞活力实验 | CCK8试剂 | -- | -- |
| 细胞迁移实验 | 无菌移液管尖 | -- | -- |
| 细胞迁移和侵袭观察 | 倒置显微镜 | ZEISS (German) | -- |
| 侵袭实验 | Matrigel基质胶 | Corning (USA) | -- |
| 结晶紫染色液 | Beyotime (China) | -- | |
| 数据分析 | Image-J | -- | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism | -- | -- |
| 计算模拟 | Schrödinger的蛋白质准备流程 | -- | -- |
| Maestro中的残基扫描模块 | -- | -- | |
| Prime MM-GBSA | -- | -- | |
| 分子动力学模拟 | Desmond程序包 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | BL21(DE3)感受态细胞；Ni²⁺-NTA beads；分子筛层析 阅读提示：Methods的Protein cloning, expression, and purification部分 |
| SPR实验 | TEAD固定于CM5芯片；Biacore 8K系统；结合亲和力测定 阅读提示：Methods的Surface plasmon resonance (SPR)部分及补充材料 |
| 细胞培养 | SCC25细胞培养基DMEM/F12；HN30细胞培养基DMEM；10% FBS；100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素；5% CO2，37°C 阅读提示：Methods的OSCC cell culture部分 |
| 细胞活力实验 | 血清饥饿12小时；干扰物浓度（包括200 µM）；处理48小时；CCK8试剂10%浓度；孵育1小时；测量OD 450nm 阅读提示：Methods的Cell viability assay部分 |
| 细胞迁移实验 | 血清饥饿12小时；划痕；处理24小时；干扰物浓度 阅读提示：Methods的Migration assay部分 |
| 细胞侵袭实验 | HN30细胞；血清饥饿12小时；Matrigel包被；处理24小时；固定20分钟；结晶紫染色 阅读提示：Methods的Invasion assay部分 |