突变鉴定与生物信息学分析
确定c-Met V110I突变在浆液性卵巢癌中的存在和频率。
使用cBioPortal数据库分析TCGA数据，确定MET基因在浆液性卵巢癌中的突变频率为5%。
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c-Met rs368750834突变和双功能CAR-T策略治疗浆液性卵巢癌的机制见解
Mechanistic insights into c-Met rs368750834 mutation and a bifunctional CAR-T strategy for serous ovarian carcinoma.
实验完整度
高包含计算模拟、细胞实验和动物实验等至少两个独立证据层级，并有功能验证（细胞毒性和细胞因子分泌）和机制验证（蛋白稳定性）。
主要模型
SKOV-3细胞系 A2780细胞系 IOSE-80正常卵巢上皮细胞 NSG小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
c-Met V110I突变对蛋白构象稳定性的影响（分子动力学模拟） SKOV-3细胞中c-Met和PD-L1表达水平（流式细胞术） CAR-T细胞转导效率和CD8/CD4比例 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率（LDH释放实验） 体内实验中CAR-T细胞给药剂量和方案
摘要
c-Met基因编码一种称为肝细胞生长因子受体（HGFR）的蛋白质，通常被称为c-Met受体。该基因及其编码的受体在正常生理过程以及多种疾病（尤其是癌症）的发生、发展和转移中发挥关键作用。然而，该基因中第110位残基的错义突变（缬氨酸变为异亮氨酸）背后的精确分子机制仍未探索。这种突变被假设影响蛋白质稳定性；然而，它如何改变c-Met的三维结构、动态行为及功能特性尚不清楚。在本研究中，我们创新性地整合了高精度结构预测、基于蛋白质模型的分子动力学模拟和AI驱动的热力学稳定性分析，以系统阐明残基110突变破坏蛋白质结构完整性、调节构象动态并最终损害受体功能的分子机制。利用c-Met作为肿瘤相关抗原，我们开发了一种分泌PD-1抗体的c-Met靶向CAR-T细胞，并在体外和体内评估了其对浆液性卵巢癌细胞系SKOV-3的细胞毒性作用。这项研究表明，c-Met第110位突变诱导蛋白质构象重编程，使其从稳定、紧凑的结构状态转变为更松散和动态灵活构象。实验证据证实，与野生型相比，这种结构改变导致卵巢癌细胞中V110I突变体的蛋白质表达水平显著升高，功能性证明了构象稳定性改变对蛋白质代谢的实质性影响。在确定c-Met蛋白作为卵巢癌潜在治疗靶点的基础上，我们开发了能够分泌抗PD-1抗体的c-Met CAR-T细胞。这些细胞对过表达c-Met的肿瘤细胞表现出显著增强的细胞毒性，并伴随干扰素-γ等关键效应细胞因子释放增加。该研究框架为克服浆液性卵巢癌CAR-T治疗反应的局限性提供了精确、协同的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- c-Met蛋白第110位错义突变（V110I）如何改变蛋白结构、稳定性及功能，以及基于c-Met和PD-L1靶点的双功能CAR-T策略在浆液性卵巢癌中的治疗效果如何？
- 核心机制
- V110I突变导致c-Met蛋白构象从紧凑稳定变为松散灵活，降低热稳定性，可能影响配体结合和信号转导；CAR-T细胞通过靶向c-Met并局部分泌PD-1抗体，同时阻断c-Met驱动的肿瘤生长信号和PD-1/PD-L1介导的免疫抑制，增强抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- 分子动力学模拟显示突变蛋白RMSD、RMSF、Rg和SASA增加；Western blot显示V110I突变体在SKOV-3细胞中高表达；IHC显示卵巢癌组织中c-Met和PD-L1高表达；体外LDH实验显示PD-1/c-Met CAR-T杀伤效率显著提高，体内实验中肿瘤体积显著减小。
- 研究意义
- 该研究提供了一种精确、协同的治疗策略，以克服浆液性卵巢癌中CAR-T治疗反应的局限性，并为c-Met过表达实体瘤的转化应用提供潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白结构预测与分子动力学模拟
评估V110I突变对c-Met蛋白结构稳定性和动态行为的影响。
使用AlphaFold3预测野生型和突变型c-Met蛋白结构，并用GROMACS进行100ns分子动力学模拟，分析RMSD、RMSF、Rg、SASA和自由能变化。
热力学稳定性预测
预测突变对蛋白质稳定性的影响。
使用ThermoMPNN预测ΔΔG值，结果显示V110I突变导致ΔΔG=+0.25 kcal/mol，表明稳定性降低。
蛋白表达验证
验证V110I突变对c-Met蛋白表达水平的影响。
在SKOV-3细胞中过表达野生型或V110I突变型c-Met，通过Western blot检测蛋白表达。
体外功能实验
评估PD-1/c-Met CAR-T细胞的增殖、细胞毒性和细胞因子分泌能力。
将CAR-T细胞与SKOV-3和A2780细胞共培养，通过CCK-8、LDH释放实验和ELISA检测相关指标。
体内抗肿瘤疗效评估
验证PD-1/c-Met CAR-T细胞在体内的抗肿瘤效果和安全性。
在NSG小鼠皮下注射SKOV-3-luc细胞建立肿瘤模型，瘤内注射CAR-T细胞，监测肿瘤体积和体重，并进行生物发光成像、HE和IHC染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875119 |
| 胎牛血清 | Gibco | A5670801 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) | Gibco | 2660233 | |
| 细胞转染 | Neofect™转染试剂 | -- | -- |
| Western blot | PAGE凝胶快速制备试剂盒 | 上海雅酶生物科技有限公司 | -- |
| SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×) | 上海雅酶生物科技有限公司 | -- | |
| c-Met抗体 | Servicebio | -- | |
| GAPDH抗体 | Servicebio | -- | |
| 抗兔二抗 | Servicebio | -- | |
| 增强化学发光(ECL)超敏化学发光试剂 | 上海雅酶生物科技有限公司 | -- | |
| 细胞培养 | 人淋巴细胞分离液 | Soleibao | -- |
| 白细胞介素2 | 北京同立海源生物 | -- | |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) | BIOSHARP | -- |
| 细胞毒性检测 | LDH释放试剂盒 | 碧云天 | -- |
| 细胞因子检测 | IFN-γ ELISA试剂盒 | 上海酶联生物 | -- |
| IL-2 ELISA试剂盒 | 上海酶联生物 | -- | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | 上海酶联生物 | -- | |
| CAR-T细胞制备 | 抗CD3/CD28激活抗体 | GK基因 | -- |
| Retronectin浓缩液 | GK基因 | -- | |
| c-Met CAR慢病毒 | GK基因 | -- | |
| PD-1/c-Met CAR慢病毒 | GK基因 | -- | |
| 流式细胞术 | 小鼠抗人CD3-APC抗体 | BD | -- |
| CD4-PE抗体 | BD | -- | |
| CD8-PerCP5.5抗体 | BD | -- | |
| c-Met-FITC抗体 | BD | -- | |
| PD-L1-PE抗体 | BD | -- | |
| 动物实验 | NSG小鼠 | 江苏青龙山生物科技有限公司 | SN652981078417477 |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 异氟烷 | rwdls | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 分子动力学模拟 | GROMACS版本、力场、水模型、模拟时间、温度、压力 阅读提示：Methods: Molecular dynamics simulation of c-Met protein |
| 细胞培养和转染 | 细胞系、转染试剂、质粒浓度、转染时间 阅读提示：Methods: Western blot (WB) |
| CAR-T细胞制备 | PBMC来源、慢病毒MOI、转导时间、IL-2浓度 阅读提示：Methods: Generation of PD-1/c-Met CAR-T and c-Met CAR-T cells |
| 体外细胞毒性实验 | 效应细胞与靶细胞比例、共培养时间 阅读提示：Methods: In vitro cytotoxicity assay (LDH Release) |
| 体内实验 | 小鼠品系、细胞接种量、肿瘤体积、给药剂量、给药时间 阅读提示：Methods: In vivo CAR-T cytotoxicity and safety evaluation |