进化分析
检测自然隐睾哺乳动物中INSL3和RXFP2的选择压力变化。
对46种哺乳动物的INSL3和RXFP2编码序列进行系统发育分析，计算dN/dS比值，使用RELAX和PGLS分析选择压力松弛和相关因素。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
INSL3和RXFP2的进化松弛与功能变化可能是哺乳动物自然隐睾的基础
Evolutionary relaxation and functional change of INSL3 and RXFP2 may underlie natural cryptorchidism in mammals.
实验完整度
高包含进化分析、细胞实验、敲入小鼠模型和转录组测序等多层级验证，明确了功能变化和机制。
主要模型
HEK293T细胞 小鼠原代引带细胞 INSL3敲入小鼠 RXFP2敲入小鼠 INSL3/RXFP2双敲入小鼠
重点核对
物种序列分析：46种哺乳动物INSL3和RXFP2的dN/dS比值 细胞实验：鲸类INSL3处理浓度（10^-8 M）及时间点 小鼠模型：INSL3-KI、INSL3-KO和WT的睾丸位置及引带组织学 生育力评估：6个月交配实验及精子活力参数 转录组分析：P8、P23、P40阶段睾丸和引带的RNA-seq
摘要
隐睾是一种常见的先天性异常，会增加成年后不育和睾丸癌的风险。然而，少数哺乳动物表现出自然未降的睾丸，同时保持正常繁殖。这种自然隐睾的机制仍不清楚。在这里，我们发现了隐睾哺乳动物INSL3和RXFP2的进化松弛，其中鲸类的dN/dS比率最高。细胞实验表明，鲸类INSL3下调cAMP-PKA-CREB通路，从而减少引带细胞的增殖和收缩。鲸类INSL3敲入小鼠表现出腹股沟位置的睾丸，几乎完美地模拟了鲸类和其他不完全降睾哺乳动物的隐睾表型。转基因小鼠引带中的胶原纤维和肌纤维减少，差异表达基因富集在肌肉发育和收缩通路中。此外，敲入小鼠表现出雄性不育、睾丸发育受损以及睾丸中炎症通路上调。我们的发现揭示了INSL3/RXFP2通路的进化变化如何促成哺乳动物的自然隐睾，并为研究隐睾物种的生殖健康和癌症抵抗提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鲸类等自然隐睾哺乳动物如何通过INSL3/RXFP2通路的进化变化维持自然隐睾状态？
- 核心机制
- 鲸类INSL3不能充分激活cAMP-PKA-CREB信号通路，导致引带细胞增殖和收缩减弱，进而影响睾丸下降的第二阶段，造成腹股沟隐睾。
- 主要证据
- 细胞实验显示鲸类INSL3降低PKA活性和CREB磷酸化，减少引带细胞增殖；INSL3-KI小鼠表现出腹股沟隐睾、引带肌肉和胶原减少；转录组显示肌肉发育和收缩相关通路下调。
- 研究意义
- 研究揭示了INSL3/RXFP2通路进化变化在自然隐睾形成中的作用，构建的隐睾小鼠模型可为研究隐睾条件下的生殖健康和肿瘤抑制提供工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞功能实验
评估鲸类INSL3对引带细胞增殖和下游信号的影响。
用重组小鼠和鲸类INSL3处理原代小鼠引带细胞，检测cAMP水平、PKA活性和CREB磷酸化，以及细胞增殖和F-actin含量。
敲入小鼠模型构建
在体内验证鲸类INSL3的功能是否导致隐睾表型。
通过同源重组将鲸类INSL3编码序列替换到小鼠内源Insl3位点，生成INSL3-KI小鼠，并进一步生成RXFP2-KI和INSL3/RXFP2双敲入小鼠，评估睾丸位置、引带发育和生育能力。
组织学和转录组分析
阐明引带和睾丸中分子和结构的变化。
对引带和睾丸进行组织学染色（H&E、Masson），并对P8和P23引带以及P8、P23、P40睾丸进行RNA-seq分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | WISENT | 319-005 |
| 胎牛血清 | WISENT | 086-150/110 | |
| 胰蛋白酶0.25%/2.21 mM EDTA（HBSS缓冲液） | WISENT | 325-043 | |
| I型胶原酶 | Diamond | A004194-0001 | |
| 6孔TC处理培养板 | BBI | F603201-0001 | |
| 药物处理 | 重组INSL3蛋白 | Bankpeptide | Customization |
| 细胞增殖检测 | CCK-8细胞计数试剂盒 | Vazyme | A311-01 |
| 细胞信号检测 | 小鼠环磷酸腺苷酶联免疫吸附测定试剂盒 | JONLNBIO | JL13362 |
| 小鼠蛋白激酶A酶联免疫吸附测定试剂盒 | JONLNBIO | JL20309 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| 180 kDa Plus预染蛋白分子量标准 | Vazyme | MP201 | |
| RT-qPCR | 2 × Rapid Taq预混液 | Vazyme | P222 |
| RNA提取 | VeZol试剂 | Vazyme | R411 |
| RT-qPCR | Hifair III第一链cDNA合成SuperMix qPCR | YEASEN | 11141ES10 |
| 组织学分析 | Bouin固定液 | Servicebio | G1121 |
| 精子分析 | 改良HTF培养基 | FUJIFILM Irvine Scientific | 90126 |
| 载体构建 | pcDNA3.1(+)载体 | Thermo Fisher | V79020 |
| 免疫共沉淀 | 兔抗INSL3抗体 | ABclonal | A5728 |
| 兔抗Flag标签抗体 | Affinity | T0003 | |
| Western blot | 兔抗CREB(磷酸化S133)抗体[E113] | Abcam | ab32096 |
| 兔抗β-微管蛋白抗体 | ABclonal | A12289 | |
| 免疫荧光染色 | Actin-Tracker Green-488 | Beyotime | C2201S |
| RNA-seq | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 进化分析 | 物种列表和序列来源、系统发育树、dN/dS计算方法 阅读提示：Methods: Species coverage and sequence acquisition, Molecular evolution analyses |
| 细胞培养 | 原代引带细胞分离的动物周龄、培养条件、重组蛋白浓度 阅读提示：Methods: Primary cell culture, Cell proliferation assay |
| 信号通路检测 | ELISA试剂盒品牌、检测时间点、PKA活性测定方法 阅读提示：Methods: ELISA for cAMP and PKA |
| 小鼠模型 | 敲入策略、基因型验证、动物饲养条件、时间点 阅读提示：Methods: Animals |
| 组织学分析 | 固定液、切片厚度、染色方法 阅读提示：Methods: Histomorphological analysis |
| 转录组分析 | RNA提取方法、文库构建试剂盒、测序平台、差异表达阈值 阅读提示：Methods: RNA-seq analysis |
| 生育力评估 | 交配方案、评估时间、精子采样和分析参数 阅读提示：Methods: Fertility studies, Computer-assisted sperm analysis |