铜死亡基因鉴定与相关性分析
鉴定与已知铜死亡核心基因相关的MSigDB铜死亡基因，并通过WGCNA分析共表达网络和相关性，筛选出UVM中特定的铜死亡基因。
从GSEA网站获取169个MSigDB铜死亡基因，与11个实验验证的铜死亡核心基因进行相关分析（阈值0.3），取四个数据库交集得到22个MSigDB基因，合并得到33个铜死亡基因；生成相关性热图并进行GO/KEGG功能分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过加权基因共表达网络分析鉴定的葡萄膜黑色素瘤中铜死亡相关枢纽基因的预后评估与实验验证
Prognostic evaluation and experimental validation of cuproptosis-related hub genes identified through weighted gene co-expression network analysis in uveal melanoma.
实验完整度
高包含多数据库转录组分析、scRNA-seq、细胞功能实验（CCK-8、EdU、凋亡、周期、ROS）及qRT-PCR验证和铜死亡抑制实验，具有独立证据层级。
主要模型
M619和92-1葡萄膜黑色素瘤细胞系 GSE139829单细胞RNA测序数据 221例UVM患者队列（TCGA-UVM、GSE22138、GSE44295、GSE84976）
重点核对
UVM样本队列：221例来自GEO和TCGA，含生存信息，批次效应校正 铜死亡诱导剂elesclomol-CuCl2（1:1比例）处理浓度及IC50（M619 201.2nM，92-1 94.5nM） 铜死亡抑制剂TTM预处理的浓度5 µM及处理时间 细胞处理时间：24小时（活力、增殖、凋亡、ROS）、12小时（细胞周期） 模型基因表达验证：单细胞RNA-seq（GSE139829）及qRT-PCR检测FDX1、ATP7B、GCSH表达
摘要
背景：葡萄膜黑色素瘤（UVM）是最常见的原发性眼内恶性肿瘤，其高转移潜力和严峻的预后构成了巨大挑战，但UVM的治疗选择有限，促使了免疫治疗的研究。铜死亡是一种最近发现的受调控的细胞死亡形式，已成为肿瘤微环境（TME）的潜在调节因子和癌症发展的调节剂。然而，铜死亡与UVM之间的关联仍不清楚。方法：使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定铜死亡基因。对221个UVM样本进行共识聚类后进行转录组相关分析和差异分析。目的是鉴定铜死亡相关基因（CRGs）。采用LASSO Cox回归方法，利用已鉴定的CRGs构建了名为CRG_score的预后模型。进行功能富集分析以探索与CRG_score相关的生物学过程。此外，研究探讨了CRG_score与多西他赛和依托泊苷等化疗药物反应性之间的关联。我们还探讨了铜死亡在细胞水平上对UVM的影响。结果：UVM患者被分为两个不同的铜死亡亚型，每种亚型具有独特的临床病理特征、预后结果、免疫检查点表达水平和免疫浸润模式。CRGs被用于开发预后模型CRG_score，该模型包含八个关键CRGs，可准确预测UVM的预后（AUC=0.895）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析进一步证实了这八个模型基因的高肿瘤细胞特异性，验证了构建CRG_score的合理性。功能富集分析表明，CRG_score与涉及细胞信号传导、免疫反应和代谢调节的通路相关。低CRG_score与多西他赛和依托泊苷等化疗药物的良好反应相关。在细胞实验中，观察到铜死亡诱导剂elesclomol可以阻碍UVM细胞的生长和增殖，导致细胞周期阻滞在G2/M期，以及促进凋亡和活性氧（ROS）的积累。结论：与先前的一些研究相比，我们非常严格地扩展了对CRGs的搜索，以增加铜死亡在UVM预后和治疗中的价值。这项全转录组分析阐明了铜死亡相关分子亚型在UVM预后中的关键作用，强调了其与TME的关联，并为临床药物决策提供了科学依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 铜死亡相关基因在葡萄膜黑色素瘤中的表达模式、预后价值及其与肿瘤微环境的关系如何？
- 核心机制
- 铜死亡通过FDX1、ATP7B和GCSH等基因的表达变化介导，诱导ROS积累、细胞周期阻滞和凋亡，抑制UVM细胞活力与增殖。
- 主要证据
- 基于33个铜死亡基因的共识聚类和LASSO-Cox构建的8基因CRG_score模型在四个独立数据集中验证预后价值；单细胞RNA-seq显示模型基因主要在肿瘤细胞表达；细胞实验显示elesclomol-CuCl2处理抑制M619和92-1细胞活力、增殖，诱导凋亡、G2/M周期阻滞和ROS积累，qRT-PCR验证FDX1升高、ATP7B和GCSH降低，TTM可逆转细胞活力抑制。
- 研究意义
- 铜死亡相关分子亚型和CRG_score具有预测UVM预后和指导化疗及免疫治疗决策的潜力，为个性化治疗策略提供科学依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基于铜死亡基因的分子亚型鉴定
基于铜死亡基因表达模式，通过共识聚类将UVM患者分为不同亚型，并分析亚型间预后和TME差异。
使用ConsensusClusterPlus对221例UVM患者进行共识聚类，得到两个铜死亡亚型（cluster A和B）；用PCA、Kaplan-Meier分析验证亚型差异；评估免疫浸润、TME评分和免疫检查点表达。
差异基因分析与基因簇鉴定
通过比较两个铜死亡亚型的转录组差异，鉴定差异表达基因（DEGs），并基于这些DEGs进一步聚类为新的基因簇。
使用limma包进行差异分析，得到1306个DEGs（logFC=0.585，p<0.05）；用单变量Cox分析筛选预后相关DEGs（1181个）；基于DEGs进行无监督聚类，得到基因簇A和B；分析基因簇间预后及免疫特征。
构建并验证铜死亡相关预后模型（CRG_score）
利用LASSO-Cox回归构建基于铜死亡相关DEGs的预后模型，并验证其预测能力。
从1181个预后CRGs中，通过LASSO-Cox回归筛选出8个模型基因（JAG2, P4HA1, SAP30, TCF12, MAPKAPK3, NICN1, PLXNB1, NKIRAS1），构建CRG_score公式；根据中位CRG_score将患者分为高低风险组；在四个独立数据集中验证模型的预后效能（Kaplan-Meier和ROC曲线）。
单细胞RNA测序分析模型基因表达
在单细胞水平上验证模型基因的细胞类型特异性表达。
从GEO获取GSE139829单细胞数据，经质量控制后获得53,362个高质量细胞；使用UMAP降维聚类，注释10种细胞类型；分析8个模型基因在各细胞类型中的表达。
细胞实验验证铜死亡诱导剂的作用
在UVM细胞系中验证铜死亡诱导剂elesclomol-CuCl2对细胞活力、增殖、凋亡、周期和ROS的影响。
使用M619和92-1细胞系，用elesclomol-CuCl2处理，CCK-8检测活力，EdU检测增殖，流式细胞术检测凋亡和细胞周期，DCFH-DA探针检测ROS，qRT-PCR检测铜死亡相关基因表达，并用TTM作为抑制剂验证铜死亡的特异性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 埃莱司他莫 | MedChemexpress | -- |
| 四硫代钼酸盐 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Selleck Chemicals | -- |
| 细胞增殖检测 | 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 | Beyotime | -- |
| Hoechst 33342 | -- | -- | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V/FITC | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 凋亡检测试剂盒 | KeyGEN BioTECH | -- | |
| 细胞周期检测 | 细胞周期检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| qRT-PCR | 细胞总RNA提取试剂盒 | Foregene | -- |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Selleck Chemicals | -- | |
| 引物 | Sangon Biotech | -- | |
| 显微镜观察 | 荧光显微镜（Cytation 5） | Bio-Tek | -- |
| 流式细胞术 | FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 数据定量 | ImagePro Plus软件（版本6.0） | -- | -- |
| 统计绘图 | Prism软件（版本9.5.1） | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据预处理与批次校正 | 四个数据集的样本量（GSE22138 n=63，GSE44295 n=57，GSE84976 n=28，TCGA n=80），数据归一化方法（RMA，TMP），批次效应校正方法（SVA） 阅读提示：参见Materials and methods：UVM datasets and preprocessing |
| 铜死亡基因筛选 | 相关系数阈值0.3，取四个数据库交集，最终33个铜死亡基因 阅读提示：参见Materials and methods：Obtaining and screening cuproptosis genes; Table 1 |
| 亚型聚类 | ConsensusClusterPlus参数（k=2），样本数221，聚类稳定性 阅读提示：参见Materials and methods：Unsupervised clustering for cuproptosis clusters and gene clusters; Figure 3a |
| 预后模型构建 | LASSO-Cox回归的λ值，8个模型基因及其系数，分组阈值（中位CRG_score） 阅读提示：参见Materials and methods：Construction and assessment of the prognostic cuproptosis-related score (CRG_score) model; Figure 4 |
| 单细胞数据处理 | GSE139829数据质量过滤参数（UMI>400，基因200-8000，线粒体<10%），聚类分辨率0.5，批次校正方法（harmony） 阅读提示：参见Materials and methods：Single-cell sequencing data collection and processing |
| 细胞实验 | 细胞系来源（M619来自BeiNa，92-1来自Procell），培养条件，药物处理浓度（IC50），作用时间（24h或12h），TTM浓度5µM 阅读提示：参见Materials and methods：Cell culture; Cell counting kit-8 assay; EdU assay; Cell apoptosis assay; Cell cycle assay; Cellular ROS assay |