单细胞转录组数据分析
描绘CRC TME中的细胞组成和异质性，鉴定关键细胞亚群。
对5个GEO数据集的37例CRC、32例癌旁正常和4例PBMC样本进行质控、聚类和注释，得到89个细胞簇和8种主要细胞类型。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PPIF+中性粒细胞通过促进mtROS驱动的NETosis介导结直肠癌的进展
PPIF+ neutrophils promote mtROS driven NETosis mediated progression of colorectal cancer.
实验完整度
中研究主要基于公开scRNA-seq数据的生物信息学分析，并辅以临床样本的免疫荧光、Western blot、qPCR和Co-IP等实验验证，但缺乏体内功能实验。
主要模型
CRC患者肿瘤及癌旁组织样本 CRC患者外周血中性粒细胞 SW480、LOVO、HCT-116人CRC细胞系
重点核对
PPIF抑制剂环孢素A处理后中性粒细胞NETs水平的变化（流式细胞术） DACH1和NKD1在HCT-116细胞中的内源性结合（Co-IP） DACH1敲低和过表达后Wnt通路相关蛋白和mRNA的表达变化（Western blot和qPCR） 临床样本中DACH1、NKD1和Wnt通路相关标志物的表达水平（Western blot和qPCR）
摘要
目的：阐明肿瘤相关中性粒细胞胞外陷阱（NETs）促进结直肠癌（CRC）进展的机制，表征CRC肿瘤微环境（TME）中的细胞群体，并识别潜在的治疗靶点。方法：我们从GEO中检索CRC的单细胞RNA-seq数据集，并对质控后的单细胞转录组数据进行聚类分析和亚群分析。随后，我们探究了不同细胞亚群中的信号通路、生物学功能、发育轨迹、生存结局、基因调控网络和细胞通讯，以描绘CRC进展过程中的肿瘤异质性。结果：我们的分析揭示，DACH1+和NKD1+ CRC亚群在CRC的发生、进展和转移中发挥重要作用。PPIF+中性粒细胞亚群通过促进线粒体活性氧（mtROS）的产生，促进NETs形成和CRC进展。同时，C1QC+ Mac、RACK1+ Tem、RACK1+ B和RACK1+ Plasma亚群在CRC TME中发挥一定的免疫抑制效应，从而促进CRC进展。此外，RACK1可能作为CRC中的一个关键生态位基因。进一步地，PPIF+中性粒细胞通过TNFSF14–TNFRSF14和TNFSF14-LTBR检查点轴调节TME，从而维持CRC进展。结论：我们的研究结果揭示了NETs影响下CRC的生物学特征。总之，本研究强调了在CRC背景下靶向NETs相关机制的治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤相关NETs如何促进结直肠癌进展，以及TME中哪些细胞亚群参与这一过程？
- 核心机制
- PPIF+中性粒细胞通过高表达PPIF促进mPTP开放和mtROS产生，从而驱动NETosis，并通过TNFSF14–TNFRSF14和TNFSF14-LTBR检查点轴调节TME，促进CRC进展。
- 主要证据
- 基于GEO和TCGA数据集的scRNA-seq和bulk转录组分析，以及临床样本的多重免疫荧光、流式细胞术、Western blot和qPCR验证，显示PPIF+中性粒细胞亚群在CRC中富集且NETs评分高，PPIF抑制降低NETs水平。
- 研究意义
- 研究揭示了NETs影响下CRC的免疫微环境特征，为靶向NETs相关机制提供治疗潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
中性粒细胞亚群分析
鉴定与NETs形成相关的关键中性粒细胞亚群。
对1,799个中性粒细胞进行聚类，鉴定出5个亚群，分析其NETs评分和基因集富集，并用多重免疫荧光和流式细胞术验证PPIF+亚群和NETs相关标志物的表达。
CRC恶性细胞亚群分析
鉴定具有更强恶性特征的CRC亚群并验证其与Wnt通路的关系。
对27,948个上皮细胞聚类得到9个CRC亚群，确定DACH1+ NKD1+亚群，并通过Co-IP、Western blot和qPCR验证DACH1和NKD1的相互作用及其对Wnt通路的影响。
免疫细胞亚群功能分析
探究巨噬细胞、T细胞、B细胞和浆细胞亚群在CRC TME中的功能状态。
对巨噬细胞、T细胞、B细胞和浆细胞进行聚类和功能分析，包括富集分析、拟时序分析和基因调控网络分析，并用多重免疫荧光和流式验证关键亚群的标志物表达。
细胞通讯分析
揭示PPIF+中性粒细胞与其他细胞间的配体-受体相互作用。
使用iTalk分析细胞通讯，发现PPIF+中性粒细胞通过TNFSF14–TNFRSF14和TNFSF14-LTBR轴与其他细胞相互作用，并通过STRING和Cytoscape构建PPI网络。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 胎牛血清 | Procell | 164210-50 | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 |
| Western blot | PVDF膜 | Merck Millipore | IPVH00010 |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Proteintech | SA00001-1 | |
| ECL化学发光试剂 | Biosharp | BL520B | |
| RNA提取 | FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒V2 | Vazyme | RC112 |
| cDNA合成 | HiScript III逆转录预混液（qPCR用，含gDNA去除） | Vazyme | R323 |
| qPCR | ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711 |
| QuantStudio6实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| 流式细胞术 | CytoFlow细胞分析仪 | Beckman | -- |
| 免疫荧光 | 三重荧光免疫组化小鼠/兔试剂盒（pH 9.0） | Immunoway Biotechnology | -- |
| 中性粒细胞分离 | Solarbio外周血中性粒细胞分离试剂盒 | Solarbio | P9040 |
| 免疫共沉淀 | rProtein A/G磁珠免疫沉淀/共免疫沉淀试剂盒 | ACE Biotechnology | BK0004-01 |
| 中性粒细胞处理 | 环孢素A | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞转录组分析 | 数据集来源（GSE161277, GSE178318, GSE188711, GSE200997, GSE201348）及质控参数（线粒体基因比例>10%过滤） 阅读提示：Materials and methods: Data collection, Processing scRNA seq data |
| 中性粒细胞NETs检测 | PPIF抑制剂环孢素A的处理浓度和时间（文中未明确说明），流式检测的NETs标志物（Cit-H3、MPO） 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry; Results: Fig. 2J |
| 细胞培养与处理 | 细胞系（SW480, LOVO, HCT-116）来源（Procell），培养基（DMEM+10% FBS+1% P/S），DACH1敲低和过表达的方法和验证（文中未明确说明具体siRNA或质粒序列） 阅读提示：Materials and methods: Cell lines; Results: Fig. 3N, 3O |
| 蛋白相互作用验证 | HCT-116细胞中免疫共沉淀使用的抗体量（anti-DACH1, anti-NKD1, anti-IgG各5 μg）和孵育时间 阅读提示：Materials and methods: Co-immunoprecipitation |
| 临床样本验证 | 临床样本的收集标准（肿瘤中心区域组织，癌旁正常组织距肿瘤边缘8-10 cm），样本量（n=3或n=4） 阅读提示：Materials and methods: Clinical sample; Results: Fig. 3M, 3P |