计算虚拟筛选
筛选TCMSP数据库中靶向CYP51的天然小分子候选物。
使用分子对接（AutoDock vina）和药效团建模（Discovery Studio）双重策略筛选数据库，并通过生物利用度和类药性预筛选。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
整合计算-实验发现α-常春藤皂苷作为靶向白色念珠菌CYP51的多机制、低毒性抗真菌剂
Integrative computational-experimental discovery of α-hederin as a multi-mechanistic, low-toxicity antifungal agent targeting Candida albicans CYP51.
实验完整度
高体外抗真菌活性、细胞毒性、生物膜、菌丝、疏水性、麦角固醇、联合用药实验，体内小鼠模型，以及分子动力学模拟等至少两个独立证据层级。
主要模型
白色念珠菌CMCC(F)98001菌株 293T、Raw264.7和KB细胞 BALB/c小鼠口腔念珠菌病模型
重点核对
α-hederin对白色念珠菌的MIC为32 μg/mL（微肉汤稀释法，37°C，24-36h） α-hederin浓度32 μg/mL时完全抑制菌丝形成，256 μg/mL时完全抑制生物膜形成 α-hederin在128 μg/mL时降低细胞表面疏水性85% 体内实验中α-hederin以32 μg/mL和128 μg/mL加入饮水中，处理5天 分子动力学模拟显示α-hederin与CYP51形成4-5个氢键，结合自由能低于氟康唑
摘要
由白色念珠菌等病原真菌引起的感染导致疾病发病率和死亡率持续上升，凸显了对更安全有效抗真菌疗法的迫切需求。目前的抗真菌药物受限于毒性和耐药性，强调创新发现策略的必要性。本研究旨在通过针对白色念珠菌CYP51（14-α-固醇脱甲基酶）的综合计算方法鉴定新型抗真菌化合物。具体而言，我们试图筛选中药系统药理学（TCMSP）数据库以获得潜在抗真菌候选物，评估其治疗潜力，并建立计算-实验框架以加速抗真菌药物开发。我们采用综合计算方法——通过分子对接和药效团建模靶向白色念珠菌CYP51——筛选TCMSP数据库。获得的两种天然小分子进行了体内和体外抗真菌实验，并通过分子对接和分子动力学模拟分析其抗真菌机制。结果产生了两种新的抗真菌候选物：α-常春藤皂苷和榄香素，对白色念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为32 μg/mL和16 μL/mL。α-常春藤皂苷表现出优越的治疗潜力，在293T、Raw264.7和KB细胞中显示低细胞毒性。它在体外有效抑制菌丝形成、生物膜形成和细胞表面疏水性。在小鼠口腔念珠菌病模型中，α-常春藤皂苷优于氟康唑，降低了真菌负荷，抑制菌丝侵袭并防止舌头粘附。分子动力学模拟显示，α-常春藤皂苷与CYP51形成的复合物比氟康唑更稳定，涉及额外的氢键、烷基相互作用和碳-氢键。本研究通过验证CYP51作为结构引导筛选的高价值靶点，鉴定α-常春藤皂苷为低毒性、多机制的抗真菌剂，并建立用于快速抗真菌开发的计算-实验框架，推进了抗真菌药物的发现。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在通过计算筛选和实验验证，发现靶向白色念珠菌CYP51的新型低毒性抗真菌化合物，以应对现有抗真菌药物的毒性和耐药性问题。
- 核心机制
- α-hederin通过抑制CYP51（14-α-固醇脱甲基酶）来阻断麦角固醇合成，同时破坏细胞膜完整性、抑制菌丝形成、生物膜形成和细胞表面疏水性，从而发挥多机制抗真菌作用。
- 主要证据
- 体外实验显示α-hederin对白色念珠菌MIC为32 μg/mL，低细胞毒性，抑制菌丝和生物膜形成；体内小鼠口腔念珠菌病模型显示其降低真菌负荷并恢复免疫指标；分子动力学模拟表明其与CYP51形成稳定复合物。
- 研究意义
- 本研究验证了CYP51作为结构引导筛选的高价值靶点，并建立了计算-实验框架以加速抗真菌药物发现，α-hederin被提出作为有前景的治疗候选物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外抗真菌活性测定
确定候选化合物对白色念珠菌的最低抑菌浓度。
采用微量肉汤稀释法测定α-hederin和elemicin对白色念珠菌的MIC，并以氟康唑为对照。
细胞毒性评价
评估候选化合物对哺乳动物细胞的毒性。
使用CCK-8试剂盒检测α-hederin、elemicin和氟康唑在293T、Raw264.7和KB细胞中的细胞活力。
超微结构观察
观察α-hederin处理对白色念珠菌细胞结构的影响。
使用SEM和TEM观察α-hederin和氟康唑处理后的细胞表面和内部结构变化。
生物膜抑制实验
评估α-hederin对白色念珠菌生物膜形成和成熟生物膜的影响。
使用结晶紫染色测定总生物膜生物量，XTT法测定代谢活性。
毒力因子抑制实验
评估α-hederin对菌丝形成、细胞表面疏水性和麦角固醇合成的影响。
在RPMI-1640培养基中诱导菌丝，测定疏水性百分比，并测定麦角固醇含量。
联合抗真菌评估
评估α-hederin与氟康唑的协同抗真菌作用。
使用棋盘微量稀释法测定FICI值。
体内药效评价
评估α-hederin对小鼠口腔念珠菌感染的治疗效果。
建立BALB/c小鼠口腔念珠菌病模型，给予α-hederin或氟康唑治疗，检测体重、真菌负荷和血液学指标。
分子动力学模拟
揭示α-hederin与CYP51结合的稳定性和相互作用机制。
使用Gromacs 4.5.1进行100ns分子动力学模拟，分析RMSD、RMSF、结合自由能、氢键等。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 菌株培养 | YEPD琼脂培养基 | -- | -- |
| YEPD液体培养基 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biosharp Co., Ltd. | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 虚拟筛选 | AutoDock vina | -- | -- |
| Discovery Studio 2019 | -- | -- | |
| 细胞毒性实验 | CCK-8试剂 | -- | -- |
| 扫描电镜 | NOVA450扫描电子显微镜 | FEI | -- |
| Nova 450扫描电子显微镜 | FEI | -- | |
| 生物膜实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| 动物实验 | 醋酸可的松 | -- | -- |
| 水合氯醛 | -- | -- | |
| Sysmax XN-550血液分析仪 | Sysmax | -- | |
| PANNORAMIC 250 FLASH玻片扫描仪 | 3DHISTECH | -- | |
| 分子动力学模拟 | Gromacs 4.5.1 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株和培养条件 | 菌株为CMCC(F)98001，YEPD培养基，30°C，220rpm过夜培养 阅读提示：Materials and methods, 'Strains, cells and growth conditions' |
| 虚拟筛选 | CYP51结构PDB:5TZ1，活性位点残基Tyr118, His310, Ser378，TCMSP预筛OB>30%, DL>18% 阅读提示：Materials and methods, 'Virtual screening of antifungal natural small molecules targeting CYP51' |
| MIC测定 | 细胞密度1×10^6 CFU/mL，浓度范围0.5-256 μg/mL或μL/mL，37°C培养24h和36h，MIC定义为生长≤未处理对照 阅读提示：Materials and methods, 'Determination of the minimum inhibitory concentration (MICs) of α-hederin and elemicin against C. albicans' |
| 细胞毒性 | 细胞密度1×10^5 cells/well，处理24h，CCK-8试剂10% v/v，孵育2h，450nm吸光度 阅读提示：Materials and methods, 'Cytotoxicity assessment of α-hederin and elemicin in Raw264.7, 293 T and KB cells' |
| 生物膜抑制 | 生物膜形成：1×10^7 CFU/mL，α-hederin浓度16-256 μg/mL，37°C 24h；代谢活性：1×10^5 cells/mL，8-128 μg/mL 阅读提示：Materials and methods, 'Determination of total biofilm biomasses' and 'Effect of α-hederin on metabolic activity of C. albicans cells during biofilm formation and in mature biofilms' |
| 菌丝形成 | RPMI-1640+10% FBS，1×10^5 CFU/mL，α-hederin浓度梯度，37°C，100rpm，24h 阅读提示：Materials and methods, 'Effect of α-hederin on the hyphal growth of C. albicans' |
| 疏水性 | 1×10^5 CFU/mL，α-hederin，28°C 1h，n-octane分配，OD600 阅读提示：Materials and methods, 'Effect of α-hederin on the cell surface hydrophobicity of C. albicans' |
| 麦角固醇含量 | 0.2g菌丝粉末，皂化液，80°C 1h，石油醚萃取，UV测定230-281nm 阅读提示：Materials and methods, 'Determination of ergosterol content in C. albicans' |
| 联合药敏 | α-hederin 8-128 μg/mL，氟康唑0.5-8 μg/mL，棋盘法，FICI计算 阅读提示：Materials and methods, 'Determination of synergistic antifungal effect of α-hederin and fluconazole against C. albicans' |
| 动物模型 | BALB/c小鼠，25-30g，25只，5组，每组5只；免疫抑制用醋酸可的松；感染1×10^8 CFU/mL；治疗α-hederin 32和128 μg/mL加入饮水，氟康唑128 μg/mL，持续5天 阅读提示：Materials and methods, 'Therapeutic effect of α-hederin on mice oral infected with C. albicans' |
| 分子动力学模拟 | Gromacs 4.5.1，100ns，300K，NPT，RMSD/RMSF，结合自由能分解 阅读提示：Materials and methods, 'Molecular dynamics simulation of the interaction between α-hederin and CYP51' |