建立AS小鼠模型并评估GTW疗效
建立AS动物模型，验证GTW对AS症状的改善作用。
通过腹腔注射蛋白聚糖和弗氏完全佐剂建立AS模型，造模后给予不同剂量GTW治疗4周，评估关节炎指数、步态评分、爪厚度及血清炎症因子水平。
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雷公藤多苷通过调节肠道菌群和代谢物重编程减轻强直性脊柱炎
Tripterygium wilfordii multi-glycoside alleviates ankylosing spondylitis via gut microbiota modulation and metabolite reprogramming.
实验完整度
高包含体内动物模型、体外细胞实验、16S rRNA测序、代谢组学分析、功能验证和机制验证。
主要模型
蛋白聚糖诱导的AS小鼠模型（BALB/c小鼠） Caco2细胞单层模型
重点核对
模型建立：10 mg蛋白聚糖与等体积弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射1 mL，共3次，间隔3周 GTW剂量：9.01、27.03、81.09 mg/kg灌胃，每日一次，持续4周 肠道通透性：FITC-dextran 70 kDa灌胃200 μL，30分钟后检测 Th17细胞检测：结肠细胞CD45、CD3、CD8、IL-17A抗体标记后流式分析 粪便代谢组学：UPLC/Q-TOF-MS/MS，正负离子模式
摘要
引言：强直性脊柱炎（AS）是一种慢性自身免疫性炎症性疾病，以中轴骨骼的严重炎症为特征。雷公藤多苷（GTW）在临床上广泛用于AS及相关免疫疾病的治疗，但其确切作用机制仍不清楚。目的：探讨GTW对AS的治疗效果及其潜在机制，重点关注其对肠道菌群及相关代谢物的影响。方法：通过腹腔注射蛋白聚糖和弗氏完全佐剂建立AS小鼠模型。通过表型分析、16S rRNA测序和代谢组学分析探讨GTW的治疗效果和潜在机制。结果：GTW显著降低了AS小鼠的关节炎指数、步态评分、爪厚度和促炎细胞因子。此外，它调节了与破骨细胞和成骨细胞分化相关的mRNA和蛋白表达，同时恢复肠道屏障完整性。值得注意的是，GTW逆转了AS诱导的双歧杆菌和阿克曼氏菌的耗竭。肠道菌群、粪便代谢物与AS相关表型之间的相关性分析表明，GTW富集的细菌与有益代谢物（包括3-甲基黄嘌呤、5'-甲硫腺苷、肉桂酸、山奈酚和棕榈酰葡糖苷酸）呈正相关。这些肠道细菌和代谢物均与AS严重程度标志物（IL-6、IL-17、IL-23、Th17细胞百分比、关节炎指数、步态评分、爪厚度和Rankl表达）呈显著负相关，并与保护因子（Zo-1、Occludin、Claudin-1、Ocn和Alp基因表达）呈正相关。结论：本研究提示GTW治疗与小鼠AS相关症状的改善相关，提示肠道菌群-代谢物轴在GTW相关的AS改善中可能发挥作用，但因果关系需要进一步验证。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨GTW对AS小鼠的治疗效果及其潜在机制，重点关注其对肠道菌群和相关代谢物的影响。
- 核心机制
- GTW可能通过调节肠道菌群（富集双歧杆菌和阿克曼氏菌）及其代谢物（如3-甲基黄嘌呤、5'-甲硫腺苷等），恢复肠道屏障功能，抑制炎症反应，从而改善AS症状，涉及肠道-骨轴。
- 主要证据
- AS小鼠模型中，GTW显著降低关节炎指数、步态评分、爪厚度和促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23），调节骨代谢标志物，恢复肠道屏障和免疫功能；16S rRNA测序显示菌群改变，代谢组学显示代谢物变化，相关性分析支持菌群-代谢物-表型关联。
- 研究意义
- 本研究首次基于肠道菌群探讨GTW治疗AS的药理机制，将肠道菌群、代谢物与宿主免疫和代谢联系起来，为AS治疗提供新的见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估GTW对骨代谢的影响
检测GTW对AS小鼠骨形成和骨吸收标志物的影响。
通过RT-PCR和Western blot检测踝关节和脊柱组织中Rankl、Alp、Ocn的mRNA和蛋白表达。
评估GTW对肠道屏障功能的影响（体内）
验证GTW是否改善AS小鼠的肠道屏障损伤。
通过H&E染色观察结肠组织病理，FITC-dextran实验测定肠道通透性，RT-PCR和Western blot检测紧密连接蛋白（Zo-1、Occludin、Claudin-1）表达，流式细胞术检测Th17细胞比例。
评估GTW对肠道屏障功能的影响（体外）
验证GTW是否直接保护肠道上皮屏障。
使用Caco2细胞单层模型，LPS诱导损伤，观察细胞形态、Occludin免疫荧光、TEER值和紧密连接蛋白表达。
肠道菌群组成分析
分析GTW对AS小鼠肠道菌群多样性和组成的影响。
对粪便进行16S rRNA V3-V4区测序，分析α多样性（Chao1、Ace、Shannon、Simpson）、β多样性（PCoA）、菌群组成和差异菌属，并预测功能通路。
粪便代谢组学分析
分析GTW对AS小鼠粪便代谢谱的影响。
利用UPLC/Q-TOF-MS/MS进行非靶向代谢组学，鉴定差异代谢物，并与AS相关表型进行相关性分析。
整合分析肠道菌群、代谢物与表型关联
探索GTW调节菌群和代谢物与AS表型的关联。
通过Spearman相关性分析、回归分析，绘制桑基图，揭示菌群、代谢物与生化指标的相关性网络。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 蛋白聚糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 弗氏完全佐剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | 雷公藤多苷 | -- | -- |
| ELISA检测 | ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 肠道通透性检测 | FITC-葡聚糖 70 kDa | -- | -- |
| 流式分析 | CD45抗体 | BD | -- |
| CD3抗体 | BD | -- | |
| CD8抗体 | BD | -- | |
| IL-17A抗体 | Elabscience | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Wuhan Pricella Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | ZhongQiaoXinZhou Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 脂多糖 | MCE | -- | |
| 免疫荧光 | 兔抗occludin抗体 | Proteintech | -- |
| 山羊抗兔IgG二抗 | CWBIO | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL化学发光试剂 | -- | -- | |
| DNA提取 | E.Z.N.A.®土壤DNA提取试剂盒 | Omega Bio-tek | -- |
| PCR扩增 | AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒 | Axygen Biosciences | -- |
| 建库定量 | Qubit 4荧光计 | Thermo Fisher | -- |
| 16S rRNA测序 | Illumina MiSeq PE300测序平台 | Illumina | -- |
| 代谢组学 | Agilent 1290 Infinity LC HILIC色谱柱 | Agilent | -- |
| Triple TOF 5600质谱仪 | AB SCIEX | -- | |
| RT-PCR | MolPure®细胞/组织总RNA提取试剂盒 | YEASEN | -- |
| Hifair® II第一链cDNA合成试剂盒 | YEASEN | -- | |
| Hieff® qPCR SYBR Green预混液 | YEASEN | -- | |
| BCA定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 组织切片扫描 | NanoZoomer 2.0-HT数字病理扫描仪 | Hamamatsu | -- |
| TEER测量 | Millicell-ERS电阻系统 | Millipore | -- |
| 引物合成 | 引物序列 | Sangon Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 蛋白聚糖和弗氏完全佐剂的乳化比例、注射剂量（1 mL/只）、注射次数（3次）及间隔（3周）、小鼠品系（BALB/c）和性别（雄性） 阅读提示：Materials and methods - Animal experiment |
| GTW给药 | GTW剂量（9.01、27.03、81.09 mg/kg）、给药方式（灌胃）、给药体积（10 mL/kg）及持续时间（4周） 阅读提示：Materials and methods - Animal experiment |
| 肠道通透性检测 | FITC-dextran分子量（70 kDa）、浓度（6.25 mg/mL）、体积（200 μL）、禁食时间（24小时）及检测时间点（30分钟后） 阅读提示：Materials and methods - Intestinal permeability |
| 流式细胞术 | 抗体组合（CD45、CD3、CD8、IL-17A）、孵育条件（室温30分钟）、分析软件（FlowJo） 阅读提示：Materials and methods - Flow cytometry analysis |
| 体外细胞实验 | Caco2细胞来源（ATCC）、LPS浓度（50 μg/L）、GTW浓度（2.8、7、14 nM）、处理时间（24小时）、TEER测定条件 阅读提示：Materials and methods - Cell treatments, Evaluation of Caco2 monolayer permeability |
| 16S rRNA测序 | 引物序列（338F/806R）、测序平台（Illumina MiSeq PE300）、数据分析软件（fastp、RDP Classifier、SILVA138） 阅读提示：Materials and methods - DNA extraction and 16S rRNA sequencing |
| 代谢组学分析 | 样本制备方法、色谱柱（Agilent 1290 Infinity LC HILIC）、质谱仪（Triple TOF 5600）、离子模式（正负）及数据处理软件（XCMS） 阅读提示：Materials and methods - Metabolomic analysis |