CD26降解剂的设计与筛选
设计并合成靶向CD26的PROTAC降解剂，并评估其与CD26的结合亲和力及形成三元复合物的能力。
基于Alogliptin和Lenalidomide设计并合成P4-1至P4-4；通过SPR测定KD值，通过NanoBRET和分子对接/动力学模拟评估三元复合物形成及稳定性。
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PROTAC介导的CD26结构-功能破坏：驱动基因阴性非小细胞肺癌的一种治疗策略
PROTAC-mediated structure-function disruption of CD26: a therapeutic strategy for driver-negative non-small cell lung cancer.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验、CDX皮下移植瘤模型、原位肺癌模型和患者来源类器官（PDOs）等多个独立证据层级，并通过功能验证（细胞活力、迁移、凋亡）和机制验证（SPR、NanoBRET、Co-IP、ROS检测等）支持结论。
主要模型
NCI-H460人肺癌细胞系 NCI-H1299人肺癌细胞系 BEAS-2B人正常肺上皮细胞系 BALB/c裸鼠皮下CDX和原位肺癌模型 患者来源类器官（PDOs）
重点核对
P4-3浓度和孵育时间：0.1-1 μM处理9小时用于降解检测，9 μM处理24小时用于细胞活力、ROS、DNA损伤等检测 给药方案：静脉注射0.6 mg/kg，每3天一次，共4次（0.6 mg/kg, 1.0% DMSO，q3d × 4） 细胞系：NCI-H460和NCI-H1299（驱动基因阴性），BEAS-2B正常对照 对照组：0.5% DMSO（体外）或含1.0% DMSO的PBS（体内） 重复数和统计：所有数据来自至少三次独立实验，以均值±标准差表示，P<0.05为统计学显著
摘要
背景：此前针对非小细胞肺癌（NSCLC）的靶向治疗主要针对驱动突变（如EGFR/ALK），导致约30%-40%突变阴性的患者缺乏有效治疗。因此，亟需针对这些患者的创新治疗策略。方法：设计并合成了靶向CD26的蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs：P4-1至P4-4）。通过表面等离子体共振（SPR）评估降解剂与CD26的结合强度。通过NanoBRET™活细胞三元复合物分析确认三元复合物的形成。使用驱动基因阴性NSCLC（NCI-H460和NCI-H1299）和BEAS-2B细胞研究降解剂的降解性能。通过细胞系来源异种移植瘤（CDX）、原位肺癌和患者来源类器官（PDOs）模型评估最优降解剂（P4-3）的治疗效果。机制研究包括免疫共沉淀、免疫荧光、活性氧（ROS）/DNA损伤检测、凋亡分析和转录组学。结果：CD26在P4-3诱导下发生网格蛋白依赖的内吞，并在蛋白降解前形成三元复合物。P4-3降解CD26导致膜结合型腺苷脱氨酶（ADA）转位至胞质，引起腺苷耗竭、线粒体ROS积累、代谢应激、DNA损伤以及体外、体内和PDOs（阴性突变）模型中的内源性凋亡。机制上，CD26降解独特地同时消除其酶活性和非酶功能，实现了传统抑制剂无法达到的双重效果。结论：靶向CD26降解是驱动基因阴性NSCLC的一种有价值的治疗策略。该方法也解决了基于驱动突变靶向治疗的局限性，为突变阴性的NSCLC患者提供了一种有前景的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探索PROTAC介导的CD26降解是否可作为驱动基因阴性非小细胞肺癌的有效治疗策略，并阐明其作用机制。
- 核心机制
- P4-3诱导CD26经网格蛋白介导的内吞进入细胞，通过蛋白酶体途径降解，导致膜结合ADA释放至胞质，引起腺苷耗竭、线粒体ROS积累、代谢应激、DNA损伤，最终激活内源性凋亡通路（Bax/Bcl2失衡、细胞色素c释放、caspase-3活化）。
- 主要证据
- 证据来自SPR和NanoBRET实验证实P4-3与CD26结合并形成三元复合物；Western blot显示CD26在NCI-H460和NCI-H1299细胞中被有效降解；体外细胞活力、Transwell迁移、ROS/DNA损伤检测及凋亡分析显示P4-3抑制细胞增殖和迁移并诱导凋亡；体内CDX和原位肺癌模型显示肿瘤生长抑制和凋亡标志物变化；患者来源类器官（PDOs）实验显示肿瘤生长抑制。
- 研究意义
- 靶向CD26降解为驱动基因阴性NSCLC提供了一种新的治疗策略，并解决了传统CD26抑制剂仅抑制酶活性而无法破坏其非酶功能的局限，具有转化为临床应用的前景。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CD26降解性能验证
验证候选降解剂在细胞中能否有效降解CD26并确定最优降解剂。
在NCI-H460、NCI-H1299和BEAS-2B细胞中处理不同浓度降解剂，通过Western blot检测CD26及同源物DPP7/8/9和FAP的水平；考察降解时间、内吞抑制剂和蛋白酶体抑制剂的影响。
体外抗肿瘤效果评估
评估P4-3对驱动基因阴性NSCLC细胞增殖和迁移的抑制作用。
使用CCK-8法测定细胞活力，计算EC50；Transwell实验评估细胞迁移能力；RNA-seq分析差异表达基因及KEGG富集。
机制研究：CD26降解诱导凋亡
阐明P4-3降解CD26后如何导致NSCLC细胞凋亡的分子机制。
通过Co-IP验证CD26与ADA结合；检测腺苷浓度、ADA亚细胞定位、ROS水平、MDA含量、DNA损伤（γ-H2AX）、线粒体膜电位（JC-1）和TEM观察线粒体形态；流式细胞术检测凋亡率；Western blot检测凋亡相关蛋白（Cyt c, Bcl2, Bax, cleaved caspase-3）。
体内抗肿瘤效果评估
在CDX皮下移植瘤和原位肺癌模型中评估P4-3的抗肿瘤效果和生物安全性。
建立NCI-H460细胞皮下和原位肺癌模型，静脉注射P4-3，记录肿瘤体积和体重，通过H&E、TUNEL、免疫荧光和Western blot检测肿瘤组织中的凋亡标志物。
患者来源类器官（PDOs）验证
在患者来源的类器官模型中验证P4-3的抗肿瘤效果和选择性。
从驱动基因阴性的NSCLC患者组织构建PDOs，检测CD26表达，用P4-3处理，评估细胞活力、凋亡标志物和MDA水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达检测 | CD26抗体 | -- | -- |
| ADA抗体 | -- | -- | |
| β-actin抗体 | -- | -- | |
| 免疫共沉淀 | Dynabeads™蛋白G免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 蛋白降解实验 | MG132 | -- | -- |
| 阿格列汀 | -- | -- | |
| 氯喹 | -- | -- | |
| Dynasore | -- | -- | |
| Pitstop 2 | -- | -- | |
| NYST | -- | -- | |
| EIPA | -- | -- | |
| 肝素 | -- | -- | |
| 来那度胺-C5-酸 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| CellTiter-Glo® 3D细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- | |
| 腺苷浓度检测 | 腺苷比色检测试剂盒 | -- | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA | -- | -- |
| DNA损伤检测 | γ-H2AX | -- | -- |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1探针 | -- | -- |
| 脂质过氧化检测 | 脂质过氧化MDA检测试剂盒 | -- | -- |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC | -- | -- |
| SPR | CM5传感芯片 | Cytiva | 29149603 |
| Biacore™ 1系列SPR系统 | Cytiva | -- | |
| Western blot | Amersham ImageQuant™ 800 Western blot成像系统 | Cytiva | -- |
| 蛋白质组学 | NanoElute超高效液相色谱系统 | Bruker Daltonics | -- |
| timsTOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonics | -- | |
| RNA-seq | TRIzol®试剂 | Invitrogen | -- |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| Qubit 4.0 | Thermo Fisher | -- | |
| 细胞活力检测 | BioTek Synergy LX多功能酶标仪 | Agilent | -- |
| 流式细胞术 | NovoCyte流式细胞仪 | Agilent | -- |
| 显微镜 | Eclipse E100光学显微镜 | Nikon | -- |
| Eclipse C1荧光显微镜 | Nikon | -- | |
| 共聚焦显微镜 | Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | -- |
| 透射电镜 | HT7800/HT7700透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CD26降解剂筛选 | SPR结合亲和力、三元复合物形成、降解效率（浓度和时间） 阅读提示：Results中“Screening of CD26 degraders”部分及图1 |
| 体外细胞实验 | 细胞系（NCI-H460、NCI-H1299、BEAS-2B）、P4-3浓度、处理时间、DMSO含量、细胞接种密度 阅读提示：Methods中“Cell lines and cell culture”、“Cell viability tests”、“Transwell assays”及图2、图3 |
| 机制研究 | Co-IP条件、ADA定位、ROS和MDA检测、DNA损伤、线粒体膜电位、凋亡蛋白表达 阅读提示：Methods中“Co-immunoprecipitation”、“ROS fluorescent imaging”、“DNA damage fluorescent imaging”、“Mitochondrial membrane potential confocal fluorescent imaging”、“MDA assay”、“Flow fluorescence analysis”及图4 |
| 体内实验 | 动物品系和周龄、细胞接种数量、P4-3剂量、给药途径和频率、对照组、肿瘤体积测量时间 阅读提示：Methods中“The anti-tumour evaluation effects on subcutaneous tumour”、“The anti-tumour evaluation effects on in situ lung cancer”及图5、图6 |
| 类器官实验 | PDO来源、P4-3浓度和处理时间、细胞活力检测方法、MDA检测 阅读提示：Methods中“The anti-cancer evaluation effects of P4-3 on organoids”及图7 |