临床样本分析
评估AML患者乳酸水平、组蛋白乳酸化与血栓风险的相关性。
检测AML患者和健康对照PBMC的糖酵解率、血浆乳酸、D-dimer，分析血栓事件发生率，并检测骨髓和PBMC中组蛋白乳酸化水平。
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己糖激酶2介导的组蛋白H3K18乳酸化通过肿瘤-内皮细胞串扰促进急性髓系白血病中PAI-1依赖性血栓形成
Hexokinase 2-mediated histone H3K18la promotes PAI-1-dependent thrombosis in acute myeloid leukemia via tumor-endothelial crosstalk.
实验完整度
高包含临床样本分析、体外细胞实验、动物模型（IVC狭窄血栓模型）及机制验证（ChIP、CUT&Tag、代谢流分析），多层级证据相互支撑。
主要模型
AML患者外周血单个核细胞（PBMC） AML细胞系（NB4、MOLM13） NCG小鼠异种移植瘤模型 HUVEC细胞
重点核对
乳酸处理浓度（20 mM）及时间（12或24小时） HK2敲低细胞系（shHK2 NB4/MOLM13）及对照（shNC） IVC狭窄手术诱导血栓模型（48小时） MCT1 siRNA敲低HUVEC 2-DG（0.5 g/kg）和AZD3965（50 mg/kg）给药方案
摘要
急性髓系白血病是一种侵袭性血液恶性肿瘤，常并发凝血功能障碍，包括血栓形成和出血，这些并发症导致不良预后。在此，我们确定乳酸驱动的组蛋白乳酸化是促进急性髓系白血病血栓形成的机制。我们证明，白血病细胞中己糖激酶2介导的糖酵解导致乳酸积累，乳酸增强组蛋白H3赖氨酸18乳酸化并上调纤溶酶原激活物抑制剂-1的表达，损害纤维蛋白溶解。急性髓系白血病细胞释放的乳酸通过单羧酸转运蛋白1被血管内皮细胞内化，放大纤溶酶原激活物抑制剂-1的表达和血栓形成风险。抑制己糖激酶2介导的乳酸产生或单羧酸转运蛋白1介导的乳酸摄取可减轻血栓形成。我们的发现揭示了急性髓系白血病中肿瘤代谢、表观遗传修饰和凝血功能障碍之间的关键联系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 急性髓系白血病中乳酸代谢、组蛋白乳酸化与凝血功能障碍之间的机制联系是什么？
- 核心机制
- HK2介导的糖酵解产生乳酸，乳酸通过MCT1进入内皮细胞，诱导组蛋白H3K18乳酸化，上调PAI-1表达，抑制纤维蛋白溶解，促进血栓形成。
- 主要证据
- 临床样本显示乳酸与D-dimer正相关；体内外实验表明乳酸或HK2敲低影响H3K18la和PAI-1表达及血栓重量；ChIP和CUT&Tag证实H3K18la富集于PAI-1启动子。
- 研究意义
- 研究揭示了肿瘤代谢与凝血功能障碍之间的联系，靶向糖酵解或降低血乳酸水平可能成为减轻AML血栓风险的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外乳酸处理实验
验证外源乳酸对AML细胞PAI-1表达和纤维蛋白溶解功能的影响。
用20 mM乳酸处理NB4和MOLM13细胞，检测组蛋白乳酸化、PAI-1表达、纤溶酶生成和纤维蛋白溶解。
HK2功能研究
确定HK2介导的乳酸产生对组蛋白乳酸化和PAI-1表达的调控作用。
敲低或过表达HK2，检测糖酵解率、乳酸水平、组蛋白乳酸化、PAI-1表达及功能，并通过ChIP和CUT&Tag分析H3K18la在PAI-1启动子的富集。
体内动物实验
验证HK2介导的乳酸产生在AML相关血栓形成中的作用。
将HK2敲低的NB4/MOLM13细胞注射入NCG小鼠，建立异种移植模型，通过IVC狭窄诱导血栓，检测血栓重量、乳酸水平、H3K18la和PAI-1表达。
内皮细胞共培养实验
探讨AML细胞释放的乳酸是否通过MCT1影响内皮细胞PAI-1表达。
用AML细胞条件培养基处理HUVEC，敲低MCT1，检测组蛋白乳酸化、PAI-1表达和纤溶功能。
药物抑制实验
评估靶向HK2或MCT1的药理抑制剂对AML小鼠血栓形成的影响。
使用MOLM13异种移植模型，给予2-DG（HK2抑制剂）和/或AZD3965（MCT1抑制剂），诱导血栓后检测相关指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| IMDM培养基 | Procell | -- | |
| HUVEC专用培养基 | Procell | -- | |
| 细胞分离 | Ficoll-Hypaque密度梯度离心液 | -- | -- |
| 纤溶酶生成实验 | 纤溶酶原 | Diapharma | -- |
| S-2251显色底物 | Boatman | -- | |
| 纤维蛋白形成和溶解实验 | 氯化钙 | Sangon | -- |
| 纤维蛋白原 | Boatman | -- | |
| 凝血酶 | Boatman | -- | |
| 纤维蛋白溶解实验 | 组织型纤溶酶原激活物 | ProSpec | -- |
| RNA提取和qPCR | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| cDNA合成 | PrimeScript™ RT试剂盒 | Takara | -- |
| qPCR | TB Green Premix Ex Taq™ II | Takara | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | GlpBio | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Merck Millipore | -- | |
| 抗Pan-Kla抗体 | PTM Bio | PTM-1401RM | |
| 抗H3K9la抗体 | PTM Bio | PTM-1419RM | |
| 抗H3K14la抗体 | PTM Bio | PTM-1414RM | |
| 抗H3K18la抗体 | PTM Bio | PTM-1406RM | |
| 抗H4K5la抗体 | PTM Bio | PTM-1407 | |
| 抗H4K8la抗体 | PTM Bio | PTM-1415RM | |
| 抗H4K12la抗体 | PTM Bio | PTM-1411RM | |
| 抗H4K16la抗体 | PTM Bio | PTM-1417RM | |
| 抗组蛋白H3抗体 | PTM Bio | PTM-1001RM | |
| 抗PAI-1抗体 | Abmart | T56901S | |
| 抗HK2抗体 | Abmart | TD6176 | |
| 抗MCT1抗体 | ABclonal | A3013 | |
| 抗AARS1抗体 | Proteintech | 17394-1-AP | |
| 抗PKM2抗体 | Proteintech | 15822-1-AP | |
| 抗PFKP抗体 | ABclonal | A20983 | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 二抗 | Proteintech | SA00001-2; | |
| ChIP-qPCR | BeyoChIP™ 酶法ChIP试剂盒 | Beyotime | -- |
| BeyoMag™ 磁珠PCR/DNA纯化试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 载体构建和病毒包装 | pHBLV-ZsGreen载体 | -- | -- |
| pLVX-ZsGreen载体 | -- | -- | |
| pSPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| pMD2G包膜质粒 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| siRNA转染 | Hieff Trans™ siRNA/miRNA转染试剂 | YEASEN | -- |
| 动物实验 | NCG小鼠 | Gempharmatech | -- |
| 标准啮齿动物饲料 | Jiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd. | XTI01FZ | |
| 乳酸钠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | MCE | -- | |
| AZD3965 | MCE | -- | |
| 免疫荧光和免疫组化 | 抗CD31抗体 | AIFang | AFRM0001 |
| 抗PAI-1抗体 | AIFang | AF03419 | |
| K-Viewer分析软件 | -- | -- | |
| ELISA | PAI-1 ELISA试剂盒 | Bio-swamp | -- |
| t-PA/PAI-1复合物ELISA试剂盒 | Camilo Biological | -- | |
| TAT复合物ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| PAI-1 ELISA试剂盒 | BOSTER | -- | |
| 乳酸测量 | 乳酸检测试剂盒 | DiaSys | -- |
| L-乳酸检测试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 代谢流分析 | Q Exactive PLUS质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| 糖酵解速率测定 | Seahorse XF 糖酵解速率测定试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| Cell-Tak细胞粘附剂 | Corning | -- | |
| RNA测序 | RNA Nano 6000检测试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| CUT&Tag | Hyperactive Universal CUT&Tag检测试剂盒（Illumina） | Vazyme | -- |
| 二抗 | Vazyme | Ab207 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | AML细胞系（NB4、MOLM13、THP-1）和HUVEC的培养条件，包括培养基、血清浓度、传代次数（HUVEC在5代内使用）。 阅读提示：Methods 中 'Cell culture' 部分 |
| 乳酸处理 | 外源乳酸处理浓度（20 mM）和时间（12或24小时）。 阅读提示：Figure 2a 图注 |
| HK2敲低/过表达 | shRNA序列、敲低效率验证、过表达载体及筛选浓度。 阅读提示：Methods 中 'Establishment of overexpression and knockdown cell Lines' 及 Figure 3c 图注 |
| 体内血栓模型 | IVC狭窄手术具体步骤、麻醉剂（Delivector Avertin）、结扎线（4-0丝线）和针头规格（30-gauge），以及术后48小时取材时间。 阅读提示：Methods 中 'Thrombosis models' 部分 |
| 药物处理 | 2-DG剂量（0.5 g/kg）和给药时间（7天），AZD3965剂量（50 mg/kg）和频率（口服每日两次，7天）。 阅读提示：Methods 中 'Thrombosis models' 部分及 Figure 7 图注 |