评估SPOCD1在ccRCC中的表达水平
确定SPOCD1在ccRCC组织和细胞系中的表达是否高于正常对照。
利用TCGA和GTEx数据库分析SPOCD1 mRNA在ccRCC(KIRC)和正常组织中的表达;通过qRT-PCR和WB检测HK-2、A498、Caki-1、786-O细胞系中SPOCD1表达;通过IHC检测13对ccRCC组织和邻近正常组织中SPOCD1蛋白表达。
SPOCD1 expression in clear cell renal cell carcinoma: its implications for the prognosis and immunotherapy.
研究包含TCGA等多数据库生物信息学分析、qRT-PCR、WB和IHC验证,但缺乏体外功能实验和动物模型等机制验证。
TCGA ccRCC队列(539例肿瘤样本) ccRCC细胞系(A498、Caki-1、786-O) 人肾皮质近曲小管上皮细胞系(HK-2) ccRCC组织及邻近正常组织(13例)
TCGA样本中SPOCD1表达高中低分组(269例高表达 vs 270例低表达,按中位数分组) qRT-PCR和WB验证SPOCD1表达,使用HK-2、A498、Caki-1和786-O细胞系,重复数n=3 IHC验证SPOCD1表达,组织样本n=13例ccRCC及匹配邻近正常组织 生存分析(OS、DSS、PFI)采用Cox回归和Kaplan-Meier方法,显著标准p<0.05 免疫浸润分析基于ssGSEA和TIMER数据库,使用Spearman相关分析
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定SPOCD1在ccRCC组织和细胞系中的表达是否高于正常对照。
利用TCGA和GTEx数据库分析SPOCD1 mRNA在ccRCC(KIRC)和正常组织中的表达;通过qRT-PCR和WB检测HK-2、A498、Caki-1、786-O细胞系中SPOCD1表达;通过IHC检测13对ccRCC组织和邻近正常组织中SPOCD1蛋白表达。
探讨SPOCD1表达水平是否与ccRCC患者的临床病理参数和预后相关。
基于TCGA数据,将患者按SPOCD1表达中位数分为高低组,分析组间TNM分期、病理分期、组织学分级等差异;运用单因素和多因素Cox回归评估OS、DSS和PFI,并构建列线图预测生存概率。
揭示SPOCD1相关基因及信号通路,探索其潜在生物学功能。
利用TCGA数据识别SPOCD1高低表达组间的差异表达基因,并进行GO和KEGG富集分析;通过GSEA鉴定SPOCD1高表达富集的信号通路。
探究SPOCD1表达水平是否与ccRCC中免疫细胞浸润相关。
使用ssGSEA和TIMER数据库分析24种免疫细胞浸润与SPOCD1表达的相关性;分析SPOCD1与免疫刺激分子、免疫抑制分子、趋化因子及受体表达的关系。
通过实验方法验证SPOCD1在ccRCC细胞系和组织中的表达水平。
采用qRT-PCR和WB检测ccRCC细胞系(A498、Caki-1、786-O)和正常肾细胞系HK-2中SPOCD1表达;采用IHC检测ccRCC和邻近正常组织中SPOCD1表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | -- |
| MEM培养基 | Procell | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | HyCyte | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| RNA提取 | EZ-press RNA纯化试剂盒 | EZBioscience | -- |
| RNA定量 | Nanophotometer N50超微量分光光度计 | IMPLEN | -- |
| 逆转录 | Hifair® III第一链cDNA合成SuperMix(qPCR) | Yeasen Biotechnology | -- |
| qRT-PCR | ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | -- |
| 荧光定量PCR检测系统 | BIOER Technology | -- | |
| SPOCD1引物 | Sangon | -- | |
| GAPDH引物 | Sangon | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | GLPBIO | -- |
| Western blot | 超敏ECL试剂盒 | GLPBIO | -- |
| Vilber成像系统 | Vilber Lourmat | -- | |
| SPOCD1抗体 | Proteintech | 22243-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 免疫组化 | 柠檬酸盐缓冲液 | Biosharp | -- |
| 牛血清白蛋白 | Biosharp | -- | |
| SPOCD1抗体 | Proteintech | -- | |
| 链霉亲和素-生物素复合物 | Dako | -- | |
| DAB显色剂 | Dako | -- | |
| 奥林巴斯显微镜 | Olympus | -- | |
| 数据分析 | SPSS 24.0软件 | SPSS Inc. | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据库分析 | TCGA-KIRC队列样本量(539例)、按SPOCD1表达中位数分组(高表达270例,低表达269例);GEPIA、UALCAN、TIMER、TISIDB数据库版本及查询设置 阅读提示:Methods 'Data source' 和 'Immune infiltration analysis' 小节 |
| 细胞培养 | 细胞系来源(ATCC)、培养基类型(DMEM/F-12、MEM、RPMI 1640)、血清和抗生素浓度(10%FBS、1%青链霉素)、培养条件(37℃,5%CO2) 阅读提示:Methods 'Cell lines and cell culture' 小节 |
| qRT-PCR | 细胞系(HK-2、A498、Caki-1、786-O)、重复数n=3、内参基因(GAPDH)、引物序列、相对定量方法(2−ΔΔCt) 阅读提示:Figure 7A 图注及 Methods 'Quantitative Real-Time (qRT-PCR)' 小节 |
| Western blot | 一抗克隆号及稀释度(SPOCD1 1:1000,GAPDH 1:50000)、蛋白上样量、转膜条件、封闭及孵育时间 阅读提示:Figure 7B 图注及 Methods 'Western blot (WB)' 小节 |
| 免疫组织化学 | 组织样本数(13例ccRCC及配对正常组织)、一抗稀释度(1:300)、抗原修复条件(柠檬酸盐缓冲液pH 6.0)、H-Score评分标准 阅读提示:Figure 7C 图注及 Methods 'Immunohistochemistry (IHC)' 小节 |