体内感染模型建立
研究基因VII型NDV感染鸡后脾脏免疫细胞动态变化
SPF鸡随机分为感染组和对照组，通过滴眼途径接种rI4-EGFP或PBS，在感染后第2、4、6天采集脾脏并制备SMNC。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
巨噬细胞是基因VII型新城疫病毒的靶细胞，并促进鸡脾脏T细胞的感染和凋亡
Macrophages are the target cells of genotype VII Newcastle disease virus and promote the infection and apoptosis of chicken splenic T cells.
实验完整度
高包含体内实验（SPF鸡感染模型）和体外实验（细胞共培养模型），并进行了功能验证（T细胞凋亡）和机制验证（巨噬细胞促进凋亡）。
主要模型
SPF鸡感染模型 鸡脾脏单个核细胞（SMNCs） 巨噬细胞-T细胞共培养模型 纯化的T细胞
重点核对
rI4-EGFP感染剂量：10^5 EID50（体内） MOI=1用于体外感染 在感染后2、4、6天检测 共培养比例：巨噬细胞:T细胞=1:4
摘要
基因VII型新城疫病毒（NDV）感染对家禽健康构成重大威胁，其特征是免疫器官严重损伤，并伴有淋巴细胞耗竭等效应。然而，这一现象背后的确切机制仍不清楚。我们目前的研究通过使用多色流式细胞术，关注了感染基因VII型NDV的鸡脾脏中巨噬细胞、T细胞和B细胞的动态变化。我们发现NDV选择性感染鸡脾脏巨噬细胞，并在感染后第4天显著增加巨噬细胞的数量。相比之下，T细胞和B细胞逐渐耗竭。体外实验表明，在基因VII型NDV感染后，与巨噬细胞共培养的T细胞比未共培养的T细胞更强烈地发生凋亡。总的来说，我们的研究结果突显了基因VII型NDV引发的鸡脾脏免疫细胞群体的变化，并阐明了巨噬细胞在T细胞耗竭中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 基因VII型NDV感染鸡脾脏后，免疫细胞群体的动态变化及T细胞耗竭的机制是什么？
- 核心机制
- 巨噬细胞作为NDV的主要靶细胞，通过分泌因子和直接接触促进T细胞凋亡和感染。
- 主要证据
- 体内实验发现巨噬细胞数量增加而T细胞减少；体外共培养实验显示巨噬细胞促进T细胞凋亡和感染，去除巨噬细胞则T细胞存活率增加。
- 研究意义
- 揭示巨噬细胞在NDV致病机制中的新作用，为抗病毒策略开发提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
免疫细胞表型分析
检测脾脏中巨噬细胞、T细胞、B细胞及其亚群的动态变化
通过多色流式细胞术对脾脏SMNC进行免疫表型分析，包括巨噬细胞（KUL01+）、B细胞（Bu-1+）、T细胞（CD3+）及其亚群。
病毒嗜性分析
确定NDV在脾脏免疫细胞中的感染嗜性
通过GFP报告基因检测不同细胞类型中GFP阳性比例，并利用流式分选和qRT-PCR检测病毒载量。
体外感染模型
评估NDV对T细胞的直接感染和杀伤作用
分离纯化T细胞（磁珠分选，纯度>95%），与SMNCs分别感染rI4-EGFP，检测T细胞存活率和病毒蛋白表达。
巨噬细胞-T细胞共培养模型
验证巨噬细胞在NDV诱导T细胞死亡中的作用
将纯化的巨噬细胞（黏附法，纯度80-90%）与T细胞按不同比例共培养，并感染NDV，检测T细胞活力和病毒感染率。
凋亡检测
分析NDV感染后巨噬细胞和T细胞的凋亡情况
使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒进行流式检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MH-S专用培养基 | Procell | -- | |
| 细胞分选 | 鸡脾脏单个核细胞分离试剂盒 | Haoyang | -- |
| CD3生物素抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-28695 | |
| 抗生物素磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| MS分离柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| 细胞计数 | SmartCell 200 | Monwei | SC1001 |
| 流式分析 | FACSAria SORP | Becton Dickinson | -- |
| FACS LSRFortessa | BD Biosciences | -- | |
| 抗体 | 小鼠抗鸡Bu-1-AF647单克隆抗体 | Southern Biotech | 8395-31 |
| 小鼠抗鸡CD45-SPRD单克隆抗体 | Southern Biotech | 8270-13 | |
| 小鼠抗鸡单核/巨噬细胞-PE单克隆抗体 | Southern Biotech | 8420-09 | |
| 小鼠抗鸡CD3-SPRD单克隆抗体 | Southern Biotech | 8200-13 | |
| 小鼠抗鸡TCRγδ-BIOT单克隆抗体 | Southern Biotech | 8230-08 | |
| 小鼠抗鸡CD8α-AF700单克隆抗体 | Southern Biotech | 8220-27 | |
| 小鼠抗鸡CD4-PACBLU单克隆抗体 | Southern Biotech | 8210-26 | |
| Brilliant Violet 510链霉亲和素 | BioLegend | 405233 | |
| 活力检测 | 可固定活力染料eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotech | C1062M |
| Annexin V | Thermo Fisher Scientific | 88-8103-72 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotech | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotech | P0012 | |
| ChemiDoc成像仪 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| RT-qPCR | 通用RNA提取试剂盒 | GENENODE | 2161 |
| HiScript II Q Select RT SuperMix预混液（含gDNA去除剂） | Vazyme | R233-01 | |
| AceQ qPCR探针预混液 | Vazyme | Q112-02 | |
| LightCycler 480 | Roche | -- | |
| 细胞筛网 | 70 µm细胞筛网 | Corning | -- |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Costar | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内感染实验 | SPF鸡周龄、数量、分组、感染途径、病毒剂量、感染后取样时间点 阅读提示：Materials and methods: Challenge experiments in chickens |
| 细胞分离与分选 | SMNC分离方法、磁珠分选平台、细胞纯度 阅读提示：Materials and methods: Splenic mononuclear cell preparation; Chicken splenic T-cell sorting by magnetic beads |
| 体外感染实验 | 细胞密度、MOI、感染时间 阅读提示：Materials and methods: NDV infection of SMNCs, T cells, and cocultured cells |
| 共培养模型 | 共培养比例、细胞密度、孔径大小 阅读提示：Materials and methods: Establishment of the macrophage–T-cell coculture model and Transwell coculture assay |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI试剂盒、染色时间、温度 阅读提示：Materials and methods: Analysis of the apoptosis of macrophages, T cells, and cocultured cells |