检测LRRC59在结直肠癌组织中的表达
验证LRRC59在CRC组织中的表达水平是否高于正常组织。
使用TIMER2.0、GEPIA和TCGA数据库分析LRRC59 mRNA表达；使用IHC和Western blot检测6对CRC及癌旁组织中LRRC59蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
LRRC59通过抑制PERK通路诱导的凋亡并促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭
LRRC59 inhibits perk pathway‑induced apoptosis and promotes cell proliferation, migration and invasion in colorectal cancer cells.
实验完整度
高包含临床组织样本、体外细胞实验、体内异种移植瘤模型等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HCT116结直肠癌细胞系 LoVo结直肠癌细胞系 BALB/c小鼠皮下异种移植瘤模型 结直肠癌患者组织样本
重点核对
LRRC59在HCT116和LoVo细胞中的敲低效率（siRNA转染，20 µM，24/48小时） 细胞增殖检测：CCK-8（5×10^3细胞/孔，24、48、72小时）和集落形成（1×10^3细胞/孔，1周） 细胞迁移和侵袭检测：Transwell（1×10^5细胞/孔，48小时）和伤口愈合（0和48小时） PERK通路抑制剂GSK处理剂量和处理时间（1 µM，12小时） 体内实验：LoVo细胞（1×10^7细胞/只）皮下注射，34天后测量肿瘤体积和重量
摘要
富含亮氨酸重复序列蛋白59（LRRC59）是一种由244个氨基酸组成的内质网膜蛋白，与多种恶性肿瘤的肿瘤发生有关。然而，其在结直肠癌（CRC）中的功能意义仍知之甚少。在本研究中，通过免疫组织化学和蛋白质印迹法评估了CRC组织中LRRC59的表达。使用集落形成、细胞计数试剂盒-8、伤口愈合和Transwell实验以及体内异种移植模型来评估LRRC59对CRC进展的影响。通过流式细胞术和蛋白质印迹法分析凋亡。通过starBase数据库和蛋白质印迹法验证了LRRC59与蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）通路之间的相互作用。结果发现，CRC组织中LRRC59的表达显著高于正常组织。在HCT116和LoVo细胞中敲低LRRC59可抑制增殖、迁移和侵袭，并促进凋亡，且PERK通路被显著激活。体内皮下肿瘤形成实验证实了这些体外发现。使用PERK通路特异性抑制剂处理可减少LRRC59敲低的HCT116和LoVo细胞的凋亡。这些发现表明，LRRC59不仅在CRC中显著上调，而且通过协调促进增殖、迁移和侵袭等促癌过程，在机制上驱动肿瘤进展。重要的是，提供了机制证据，表明LRRC59通过抑制PERK信号轴来抑制凋亡，从而将该分子确定为开发CRC治疗策略的一个靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LRRC59在结直肠癌中的表达水平及其对肿瘤进展的生物学功能和分子机制是什么？
- 核心机制
- LRRC59通过抑制PERK介导的内质网应激信号通路，抑制细胞凋亡，从而促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
- 主要证据
- 通过IHC和Western blot证实LRRC59在CRC组织中高表达；在HCT116和LoVo细胞中敲低LRRC59抑制增殖、迁移和侵袭并促进凋亡，同时激活PERK通路；使用PERK抑制剂GSK可逆转凋亡；体内异种移植模型证实敲低LRRC59抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- LRRC59可能作为结直肠癌治疗的潜在靶点，通过间接调节PERK通路可能提供一种安全的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
敲低LRRC59并验证敲低效率
在HCT116和LoVo细胞中建立LRRC59敲低模型，为后续功能实验提供基础。
使用siRNA转染HCT116和LoVo细胞，通过RT-qPCR和Western blot验证敲低效率。
评估LRRC59对细胞增殖的影响
探究LRRC59敲低对CRC细胞增殖能力的影响。
使用CCK-8和集落形成实验检测敲低LRRC59后细胞的增殖能力。
评估LRRC59对细胞迁移和侵袭的影响
探究LRRC59敲低对CRC细胞迁移和侵袭能力的影响。
使用划痕愈合实验和Transwell实验（有无Matrigel）检测迁移和侵袭能力。
检测LRRC59对PERK通路的影响
探究LRRC59是否调控PERK介导的内质网应激信号通路。
通过starBase数据库分析LRRC59与PERK通路基因的相关性；通过Western blot检测敲低LRRC59后PERK通路相关蛋白的表达。
评估LRRC59对细胞凋亡的影响
探究LRRC59敲低是否诱导CRC细胞凋亡。
使用流式细胞术和Western blot检测凋亡细胞比例及凋亡相关蛋白表达。
验证LRRC59通过PERK通路调控凋亡
验证LRRC59是否通过PERK通路抑制凋亡。
在LRRC59敲低细胞中使用PERK抑制剂GSK处理，检测凋亡水平和PERK通路蛋白表达。
体内验证LRRC59对肿瘤生长的影响
评估LRRC59敲低在体内对肿瘤生长的影响。
使用稳定敲低LRRC59的LoVo细胞建立皮下异种移植瘤模型，测量肿瘤体积和重量，并通过IHC分析PERK通路激活。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | 11875119 |
| 胎牛血清 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | A5670701 | |
| 青霉素-链霉素 | Seven Innovations Biological Technology Co., Ltd | SC118 | |
| DMEM培养基 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | PM150210 | |
| 药物处理 | PERK抑制剂GSK | MedChemExpress | HY-13820 |
| 细胞转染 | 脂质体3000 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | L3000015 |
| 慢病毒包装 | RNAi-Mate转染试剂 | GenePharma Co., Ltd. | G04001 |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | MilliporeSigma | H9268 |
| 药物筛选 | 嘌呤霉素 | MedChemExpress | HY-B1743 |
| RNA提取 | RNAkey™总RNA提取试剂 | Seven Innovations Biological Technology Co., Ltd. | SM139-02 |
| RT-qPCR | 两步法逆转录定量PCR试剂盒 | Seven Innovations Biological Technology Co., Ltd. | SRQ-01 |
| QuantStudio™ 5系统 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂 | Seven Innovations Biological Technology Co., Ltd. | SC119 |
| Transwell实验 | Transwell小室（8 µm孔径） | Corning, Inc. | 3422 |
| 基质胶 | Corning, Inc. | 354230 | |
| 免疫组织化学 | 正常山羊血清 | Servicebio Technology Co., Ltd. | G1208-5ML |
| 抗LRRC59抗体 | Proteintech Group, Inc. | 27208-1-AP | |
| 抗GRP78抗体 | Proteintech Group, Inc. | 11587-1-AP | |
| 抗p-PERK抗体 | Invitrogen | PA5-40294 | |
| 抗ATF4抗体 | Proteintech Group, Inc. | 28657-1-AP | |
| 抗CHOP抗体 | Proteintech | 15204-1-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Servicebio Technology Co., Ltd. | G1213 | |
| DAB显色试剂盒 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1212 | |
| 蛋白质提取 | 蛋白质印迹和免疫沉淀用细胞裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0013 |
| 磷酸酶抑制剂 | Seven Innovations Biological Technology Co., Ltd. | SW106 | |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd. | KGB2101 |
| Western blotting | 预染蛋白分子量标准品 | Seven Innovations Biological Technology Co., Ltd. | SW176 |
| PVDF膜 | MilliporeSigma | ISEQ00005 | |
| β-微管蛋白抗体 | Bioworld Technology, Inc. | AP0064 | |
| 抗LRRC59抗体 | Proteintech Group, Inc. | 27208-1-AP | |
| 抗GRP78抗体 | Proteintech Group, Inc. | 11587-1-AP | |
| 抗PERK抗体 | Proteintech Group, Inc. | 24390-1-AP | |
| 抗p-PERK抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | AP1501 | |
| 抗ATF4抗体 | Proteintech Group, Inc. | 81798-1-RR | |
| 抗p-EIF2α抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | AP0692 | |
| 抗EIF2α抗体 | Proteintech Group, Inc. | 82936-1-PBS | |
| 抗CHOP抗体 | Proteintech Group, Inc. | 15204-1-AP | |
| 抗Caspase 3抗体 | Proteintech Group, Inc. | 82202-1-RR | |
| 抗活化caspase-3抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A11021 | |
| 抗Bax抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A19684 | |
| 抗Bcl-2抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A19693 | |
| 辣根过氧化物酶标记的兔二抗 | Abcam | AS014 | |
| 辣根过氧化物酶标记的小鼠二抗 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | AS003 | |
| 超敏ECL化学发光试剂 | Shanghai Yeasen Biotechnology Co., Ltd. | 36208ES60 | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Shanghai Yeasen Biotechnology Co., Ltd. | 40302ES50 |
| 0.25%无EDTA胰酶 | Seven Innovations Biological Technology Co., Ltd. | SC108 | |
| NovoCyte Advanteon流式细胞仪 | Agilent Technologies, Inc. | -- | |
| 动物实验 | 三溴乙醇 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LRRC59表达分析（临床样本） | 组织样本来源、患者临床病理信息（6例，中位年龄69.5岁，5男1女）、LRRC59抗体及稀释度、IHC和Western blot步骤 阅读提示：Materials and methods: Tissue sample collection, IHC, Western blotting; Table I; Figure 1 |
| 细胞培养与转染 | HCT116和LoVo细胞系来源、培养基（RPMI-1640）、血清浓度（10%）、抗生素（1%青霉素-链霉素）、培养条件（37°C, 5% CO2）、siRNA浓度（20 µM）、转染试剂（Lipofectamine 3000）、转染后收获时间（24或48小时） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection |
| 细胞增殖实验 | CCK-8检测：细胞接种密度（5×10^3细胞/孔）、检测时间点（24, 48, 72小时）、CCK-8处理时间（2小时）、波长（450 nm）；集落形成：细胞接种密度（1×10^3细胞/孔）、培养时长（1周）、固定和染色条件（10%甲醇15分钟，0.1%结晶紫30分钟） 阅读提示：Materials and methods: CCK-8 assay, Colony formation assay; Figure 2 |
| 迁移和侵袭实验 | Transwell：细胞密度（1×10^5细胞/孔）、小室孔径（8 µm）、基质胶包被（37°C, 6小时）、孵育时间（48小时）；划痕实验：细胞融合度（90%）、划痕时间点（0和48小时） 阅读提示：Materials and methods: Scratch wound healing assay, Migration and invasion assays; Figure 3 |
| PERK通路蛋白检测 | Western blot检测蛋白（GRP78, p-PERK, PERK, ATF4, p-EIF2α, EIF2α, CHOP）及其抗体和稀释度、细胞内蛋白提取和定量步骤 阅读提示：Materials and methods: Western blotting and antibodies; Figure 4 |
| 细胞凋亡检测 | 流式细胞术染色试剂盒（Annexin V-FITC/PI）、细胞处理步骤、检测仪器和分析软件；Western blot检测凋亡相关蛋白（Bcl-2, Bax, Caspase3, active-caspase-3） 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry, Western blotting; Figure 5 |
| PERK抑制剂处理 | GSK浓度（1 µM）、处理时间（12小时）、处理细胞系（LRRC59敲低HCT116和LoVo） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection; Figure 6 |
| 体内异种移植瘤模型 | 小鼠品系（BALB/c雌性）、周龄（5周）、体重（18.23±0.74 g）、样本量（n=10，每组5只）、细胞注射量（1×10^7细胞/只）、注射体积（100 µl）、肿瘤测量间隔（3天）、实验终点（34天）、肿瘤体积和重量测量、IHC分析PERK通路 阅读提示：Materials and methods: Xenograft tumor formation; Figure 7 |