G-GEB制备与提取
获得姜制天麻药材及其提取物，用于后续药效和成分分析
天麻饮片用姜汁闷润2小时后，在150℃下与20 mL姜汁炒制7分钟制备G-GEB；GEB和G-GEB粉末用50%乙醇回流提取两次，合并滤液浓缩冻干。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
姜制天麻中的Parishin E通过调节组蛋白H3K18la和H3K27la位点的乳酸化修饰缓解类风湿关节炎
Parishin E from ginger-processed Gastrodia elata Bl. alleviates rheumatoid arthritis by regulating histone 3 lactylation at H3K18la and H3K27la sites.
实验完整度
高包含CFA诱导的AIA大鼠模型、RAW264.7细胞炎症模型，以及植物/血浆代谢组学、转录组学、GC-MS代谢组学、Western blot、分子对接等多层级验证，并进行了功能验证和机制研究。
主要模型
Sprague-Dawley (SD)大鼠CFA诱导的佐剂性关节炎（AIA）模型 RAW264.7小鼠巨噬细胞系（LPS诱导的炎症模型）
重点核对
G-GEB剂量为201.39 mg/kg/day（高剂量），连续给药28天 RAW264.7细胞LPS刺激浓度为1 μg/mL PE处理浓度为32 μM（体外实验） 分子对接预测PE与SIRT6的结合能为-8.4 kcal/mol 实验重复次数：体内实验每组n=6，体外实验重复3次
摘要
背景：本研究探讨了源自兰科植物天麻（Gastrodia elata Bl., GEB）的天然小分子药物Parishin E（PE）。我们评估了姜制天麻（G-GEB）对类风湿关节炎（RA）的治疗效果，并聚焦于Parishin E以阐明其潜在调控机制。方法：构建Sprague-Dawley大鼠类风湿关节炎模型，评估G-GEB的药理作用。植物非靶向代谢组学、血清非靶向代谢组学和RAW264.7炎症模型阐明Parishin E是G-GEB的核心抗炎成分。随后，进行转录组学和代谢组学分析以阐明Parishin E治疗RA的分子信号机制。结果：G-GEB显著改善RA，通过非靶向代谢组学鉴定出363种活性化合物。其主要的活性成分PE通过下调HK2和LDHA影响细胞糖酵解，从而抑制巨噬细胞极化。PE还通过抑制H3K18la和H3K27la位点的H3乳酸化显示抗炎特性。结论：G-GEB中的PE通过调控细胞糖酵解抑制巨噬细胞极化，并抑制组蛋白H3特定位点（特别是H3K18la和H3K27la）的乳酸化修饰，从而发挥RA改善作用。因此，PE是开发RA治疗药物的有前景的候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 姜制天麻（G-GEB）如何通过其活性成分Parishin E（PE）发挥对类风湿关节炎（RA）的治疗作用，其分子机制是什么？
- 核心机制
- PE通过下调糖酵解关键酶HK2和LDHA抑制巨噬细胞糖酵解和M1极化，并通过SIRT6介导的H3K18la和H3K27la乳酸化修饰的调节来发挥抗炎作用。
- 主要证据
- 在CFA诱导的AIA大鼠模型中G-GEB改善关节炎症状；体外RAW264.7细胞实验中，PE抑制LPS诱导的炎症因子表达、M1极化标志物，调节糖酵解相关基因和蛋白，并降低H3K18la和H3K27la水平；分子对接显示PE与SIRT6有强结合。
- 研究意义
- 研究为姜制天麻增强天麻抗RA疗效提供了化学基础，并提示PE作为RA治疗的潜在候选药物，为临床应用G-GEB提供支持。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AIA大鼠模型建立与G-GEB药效评估
在体内验证G-GEB对类风湿关节炎的治疗效果
42只雄性SD大鼠随机分为7组（n=6），除对照组外，所有大鼠在第0天于左后爪皮下注射0.1 mL CFA诱导AIA模型。第7天开始给药，MTX组口服0.2 mg/kg甲氨蝶呤，每周三次；GEB和G-GEB组分别灌胃相应剂量的提取物，每天一次，连续28天。通过测量体重、足趾肿胀、关节炎评分、胸腺和脾脏指数以及组织病理学染色评估疗效。
植物非靶向代谢组学分析
比较GEB和G-GEB的化学成分差异，识别加工后含量显著变化的化合物
对GEB和G-GEB样本进行非靶向代谢组学分析，使用UPLC-QE-HF高分辨质谱仪检测，通过PCA、OPLS-DA等多元统计分析和数据库比对鉴定差异化合物。
血浆代谢组学分析
鉴定G-GEB给药后大鼠血浆中的原型成分和代谢物，确定体内暴露的关键活性成分
SD大鼠灌胃G-GEB乙醇提取物（201.39 mg/kg/day）7天，收集血浆，经蛋白沉淀处理后进行UPLC-QE-MS分析，通过数据库比对鉴定血浆中的化学成分。
细胞活力检测
评估PE对RAW264.7细胞的毒性，确定后续实验的安全浓度范围
将RAW264.7细胞以每孔5000个接种于96孔板，用不同浓度PE (1-256 μM)处理24小时，然后加入CCK-8试剂孵育3小时，在450 nm处测量吸光度。
体外抗炎活性验证
验证PE对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用
用LPS刺激RAW264.7细胞建立炎症模型，并用不同浓度PE (8,16,32 μM)处理。通过观察细胞形态、免疫荧光检测M1标志物（CD86, iNOS）、RT-PCR检测炎症因子基因表达、Western blot检测炎症相关蛋白表达。
转录组学分析
揭示PE对LPS刺激的RAW264.7细胞基因表达谱的影响，特别是与糖酵解相关的通路
提取对照组、LPS组、LPS+PE组的RAW264.7细胞RNA，进行转录组测序（BGISEQ-500平台），分析差异表达基因、GO富集和GSEA通路富集。
代谢组学分析（GC-MS）
分析PE对LPS刺激的RAW264.7细胞代谢谱的影响，特别是糖酵解相关代谢物
用LPS和PE处理细胞24小时，提取细胞内代谢物，通过GC-MS检测，并使用PCA、PLS-DA、OPLS-DA等多元统计分析和KEGG通路富集分析。
糖酵解关键酶表达检测
验证PE对糖酵解通路关键酶表达的影响
通过RT-PCR和Western blot检测LPS和PE处理细胞中GLUT1, HK2, PKM2, LDHA的mRNA和蛋白表达水平。
乳酸化修饰检测
检测PE对组蛋白乳酸化修饰的影响，特别是H3K18la和H3K27la
通过Western blot检测总蛋白乳酸化水平（Pan Kla）、核组蛋白乳酸化水平及特定位点（H3K18la, H3K27la），并使用In-cell Western验证。
分子机制探究（分子对接与SIRT6验证）
预测并验证PE与乳酸化修饰相关酶的相互作用，确定关键靶点
使用AutoDock Vina分子对接预测PE与25种乙酰转移酶/去乙酰化酶的结合能力，筛选出结合最强的酶。通过Western blot检测LPS和PE处理后相关酶的表达变化，并使用免疫荧光验证SIRT6的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | Parishin E | ProSpec Bio-Tech Co., Ltd. | 952068-57-4 |
| 甲氨蝶呤 | ProSpec Bio-Tech Co., Ltd. | 498-02-2 | |
| 细胞炎症模型诱导 | 脂多糖 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 动物模型诱导 | 完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| Western blot | HRP标记的山羊抗小鼠IgG (H+L) | Solarbio | SE131 |
| HRP标记的山羊抗兔IgG (H+L) | Solarbio | SE134 | |
| IL-6抗体 | Proteintech | IL6-b | |
| TNF-α抗体 | ABclonal | A20851 | |
| MMP1抗体 | Boster Bio | PB0764 | |
| MMP9抗体 | Boster Bio | BM4089 | |
| MMP13抗体 | Abcam | ab315267 | |
| GLUT1抗体 | WanLeiBio | WL01163 | |
| HK2抗体 | Proteintech | 22029-1-AP | |
| PKM2抗体 | Proteintech | 15822-1-AP | |
| LDHA抗体 | Beyotime | AF0216 | |
| H3K18la抗体 | PTM BIO | PTM-158 | |
| H3K27la抗体 | PTM BIO | PTM-160 | |
| Pan Kla抗体 | PTM BIO | PTM-1425 | |
| β-Actin抗体 | Solarbio | K101527P | |
| Histone H3抗体 | PTM BIO | PTM-312 | |
| SIRT6抗体 | ZenBio | AR381408 | |
| HDAC1抗体 | ZenBio | R24533 | |
| SIRT1抗体 | Zen Bio | R25721 | |
| SIRT2抗体 | Zen Bio | R25722 | |
| SIRT7抗体 | Proteintech | 12994-1-AP | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Pricella | 164210-50 |
| 胎牛血清 | Pricella | -- | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| Beyotime试剂盒 | Beyotime | -- | |
| RNA提取 | TRIZOL试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-PCR | 逆转录试剂盒 | Vazyme Biotech | -- |
| In-cell western | Cell Label 700 Staining ICW试剂盒 | Gene Company | 926-42091 |
| 代谢组学分析 | Waters ACQUITY UPLC I-Class plus超高效液相色谱 | Waters | -- |
| Thermo-QE-HF高分辨质谱仪 | Thermo | -- | |
| ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| GC-MS分析 | Trace 1300 气相色谱-质谱联用仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| CCK-8检测 | 酶标仪 | BioTek | -- |
| RNA-seq | BGISEQ-500测序平台 | BGI Genomics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AIA大鼠模型建立与给药 | SD大鼠品系、体重（180±20g）、CFA注射剂量（0.1 mL）和部位（左后爪）、给药方案（剂量、频率、时长） 阅读提示：Materials and Methods：Construction and treatment of CFA-Induced Adjuvant Arthritis (AIA) in rats |
| 体外细胞炎症模型 | RAW264.7细胞来源、LPS浓度（1 μg/mL）、PE处理浓度（8,16,32 μM）、处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and Methods：Cell culture、Cell viability of RAW264.7 cells was detected by the CCK-8 method；Results：PE significantly inhibits LPS-induced inflammatory response |
| Western blot分析 | 一抗和对应二抗的稀释比例、抗体来源和货号、蛋白上样量、封闭条件（5%脱脂牛奶，2小时）、抗体孵育时间和温度 阅读提示：Materials and Methods：Western blotting assay |
| RT-PCR分析 | 引物序列、RNA提取方法、逆转录反应条件、qPCR反应条件（循环参数） 阅读提示：Materials and Methods：Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)、Table 1 |
| 分子对接 | 软件版本（AutoDock Vina）、蛋白和配体结构来源、结合能阈值（-8.4 kcal/mol） 阅读提示：Results：PE attenuates cellular inflammation and ameliorates RA in vitro model systems by modulating SIRT6-mediated H3K18la and H3K27la |