F. nucleatum阳性肿瘤中CAFs激活的观察
验证F. nucleatum阳性肿瘤是否表现出更高的CAFs激活水平
对CRC组织样本进行转录组测序，根据F. nucleatum丰度分组，进行GO和KEGG富集分析；通过免疫荧光和Western blot检测CAFs标志物（Vimentin, FAP, α-SMA）表达。
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具核梭杆菌通过TLR2-YAP信号轴上调癌症相关成纤维细胞中CTGF表达，从而促进结直肠癌进展
Fusobacterium nucleatum increases CTGF expression through TLR2-YAP signaling axis in cancer-associated fibroblasts, thereby promoting colorectal cancer progression.
实验完整度
高文献包含多个独立证据层级：体外细胞实验（共培养、功能实验）、RNA-seq转录组分析、体内异种移植模型，并包含功能验证（shRNA敲低）和机制验证（TLR2/YAP通路）。
主要模型
癌症相关成纤维细胞（CAFs） 结直肠癌细胞系HCT116和LoVo BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型 结直肠癌患者组织样本
重点核对
F. nucleatum感染CAFs的MOI（10:1、20:1、50:1、100:1） 共培养时间（24h、48h、72h、96h） CAFs与F. nucleatum共培养后制备条件培养基 CTGF和TLR2敲低使用慢病毒（shRNA） 体内实验中每组小鼠数量（n=3）
摘要
具核梭杆菌（F. nucleatum）日益被认为是结直肠癌（CRC）进展的微生物驱动因素，其作用机制包括免疫调节、炎症失调和致癌信号级联的激活。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境（TME）中的主要基质成分，在协调肿瘤发生过程中发挥关键作用。虽然F. nucleatum与上皮和免疫区室的相互作用已被广泛表征，但其与CAFs的免疫串扰仍不清楚。通过包括RNA测序和异种移植模型中的功能验证在内的多模式实验方法，我们描绘了一种新的TLR2/YAP/CTGF信号轴，介导F. nucleatum驱动的CAFs激活。具体来说，F. nucleatum定植诱导TLR2依赖性YAP去磷酸化，促进其核转位和CTGF的反式激活，CTGF是基质-肿瘤串扰的经典调节因子。临床上，在人类CRC标本中，CTGF表达升高与F. nucleatum载量相关。这些发现将CTGF定位为微生物驱动的结直肠癌发生中的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- F. nucleatum是否通过与CAFs的相互作用促进结直肠癌进展，其潜在机制是什么？
- 核心机制
- F. nucleatum通过上调CAFs中TLR2表达，导致YAP去磷酸化和核转位，进而促进CTGF表达，从而增强CRC细胞的增殖和迁移。
- 主要证据
- RNA-seq显示CAFs中CTGF上调；TLR2敲低降低CTGF表达；体内异种移植模型显示CAF+F.n组肿瘤体积和重量增加，而shCTGF和shTLR2组降低。
- 研究意义
- 揭示肠道微生物通过肿瘤微环境调节CRC进展的新机制，并将CTGF定位为微生物驱动的结直肠癌发生中的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证F. nucleatum感染CAFs及其对CRC细胞的作用
确定F. nucleatum能否感染CAFs，并评估感染后CAFs条件培养基对CRC细胞增殖和迁移的影响
通过免疫荧光和扫描电镜观察F. nucleatum与CAFs的共定位和入侵；用不同MOI的F. nucleatum感染CAFs制备条件培养基，进行CCK-8、EdU、划痕和Transwell实验检测CRC细胞增殖和迁移。
鉴定F. nucleatum诱导CAFs分泌的CTGF
在转录组水平上鉴定F. nucleatum感染CAFs后差异表达基因，并验证CTGF的mRNA和蛋白水平变化
对F. nucleatum处理组和对照组CAFs进行转录组测序，分析差异表达基因；通过RT-qPCR和Western blot验证CTGF表达；ELISA检测CTGF分泌；免疫荧光检测CTGF和FAP信号。
验证CTGF在F. nucleatum感染CAFs促进CRC进展中的作用
确定CTGF是否介导F. nucleatum感染CAFs的促肿瘤功能
在CAFs中敲低CTGF（shRNA），确认敲低效率后，用条件培养基处理CRC细胞，进行CCK-8、EdU、划痕、Transwell实验，并检测EMT标志物（N-cadherin, E-cadherin）表达。
阐明TLR2-YAP通路介导CTGF上调的机制
验证F. nucleatum通过TLR2-YAP通路诱导CTGF表达的机制
通过Western blot检测YAP核转位、TLR2表达、YAP磷酸化水平；用热灭活的F. nucleatum处理CAFs比较效果；敲低TLR2后检测CTGF表达。
体内验证F. nucleatum感染CAFs对肿瘤进展的作用
在体内模型中验证F. nucleatum感染CAFs对肿瘤生长和侵袭的影响，并确认TLR2和CTGF的作用
用不同处理的CAFs条件培养基与HCT116细胞混合接种于裸鼠皮下，监测肿瘤体积和重量；进行免疫组化检测Ki67、N-cadherin、E-cadherin表达。
临床样本和TCGA数据分析验证CTGF表达与F. nucleatum的关系
验证临床CRC样本和TCGA数据中CTGF表达与F. nucleatum丰度的关系
对CRC组织进行免疫荧光检测CTGF和CAFs标志物；分析TCGA数据库中F. nucleatum阳性和阴性样本的CTGF表达差异。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | BHI培养基 | Solarbio | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| Ham's F-12k培养基 | Procell | -- | |
| Maccoy's 5A培养基 | Procell | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5x) | Beyotime | -- | |
| PAGE凝胶快速制备试剂盒 | Epizyme | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Meck | -- | |
| 快速封闭液 | Beyotime | -- | |
| 抗体稀释液 | Beyotime | -- | |
| 增强化学发光检测试剂盒 | Abbkine | -- | |
| PageRuler 26616蛋白marker | Thermo Scientific | -- | |
| 细胞免疫荧光 | Triton X-100 | Beyotime | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 细菌共定位 | FITC染料 | Qiyue | -- |
| RNA-seq | Illumina链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | -- | -- |
| 含gDNA去除剂的逆转录试剂盒 | Toyobo | -- | |
| SYBR Green实时PCR预混液 | Toyobo | -- | |
| 基因组DNA纯化试剂盒 | Tiangen | -- | |
| EdU实验 | 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 | Beyotime | -- |
| Click工作液 | Beyotime | -- | |
| Transwell迁移实验 | Transwell系统 | Corning | -- |
| 3D球体增殖实验 | 96孔超低吸附细胞培养板 | Corning | -- |
| 大鼠尾胶原 | -- | -- | |
| 慢病毒转染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 异种移植瘤模型 | BALB/c裸鼠 | Vitonex | -- |
| 免疫组化 | EDTA溶液 | ZSBIO | -- |
| DAB显色液 | ZSBIO | -- | |
| 中性树胶 | Solarbio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养 | F. nucleatum（ATCC 25586）在BHI培养基中，37℃厌氧培养48小时，8000 rpm离心10分钟，重悬于50% BHI/50%甘油中，-80℃保存。 阅读提示：Materials and methods, Culture of bacteria |
| 细胞培养 | 新鲜CRC组织样本来自哈尔滨医科大学第一医院；CAFs通过差异贴壁法分离；培养于含15% FBS的DMEM培养基；LoVo细胞培养于Ham's F-12k培养基（10% FBS），HCT116细胞培养于Maccoy's 5A培养基（10% FBS）。 阅读提示：Materials and methods, Isolation and culture of cells |
| F. nucleatum与CAFs共培养 | F. nucleatum与CAFs共培养的MOI（10:1, 20:1, 50:1, 100:1）和时间（24h, 48h, 72h, 96h）。 阅读提示：Materials and methods, CCK-8 experiment; Results, F. nucleatum-infected CAFs promote CRC cell proliferation and migration through paracrine effects |
| 功能实验 | CCK-8实验：每孔5000个HCT116或LoVo细胞，条件培养基处理24小时，在0h、24h、48h、72h检测OD450；EdU实验：24孔板细胞，条件培养基处理，EdU孵育2小时；划痕实验：200μL枪头划痕，0h和24h拍照；Transwell实验：上室细胞悬液，下室含20% FBS培养基，24小时后固定染色。 阅读提示：Materials and methods, CCK-8 experiment, EDU experiment, Wound-healing assay, Transwell migration assay |
| 慢病毒转染 | CAFs以2×10^5细胞/孔接种于24孔板，加入含6μg/ml Polybrene的培养基和病毒悬浮液，4h后补充新鲜培养基，24h后更换新鲜培养基，3-4天后评估转染效率。 阅读提示：Materials and methods, Cell lentiviral transfection |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠（8周龄，雌性，19-21g），每组3只；皮下注射HCT116细胞（5×10^6）与不同处理的CAFs条件培养基的混合物；每3天测量肿瘤体积；第21天处死小鼠，切除肿瘤，固定于4%多聚甲醛。 阅读提示：Materials and methods, Establishment of xenograft tumor model in nude mice |