建立MicroFAST工作流程
验证基于IFN-γ分泌的单细胞功能性筛选平台能否检测抗原特异性CD8+ T细胞激活
在Lightning平台上，将IFN-γ捕获珠、单克隆CD8+ T细胞和APCs依次加载至OptoSelect 1500芯片的NanoPen中，共培养过夜，染色成像后鉴定阳性NanoPen，并卸载细胞用于TCR测序。
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使用不依赖表位信息的光流控系统鉴定抗原特异性功能性CD8+ T细胞
Identification of antigen-specific functional CD8+ T cells using an optofluidic system independent of epitope information.
实验完整度
高文献包含基于Lightning平台的MicroFAST工作流程建立、已知表位验证（HCMV NLV）、未知表位筛选（SARS-CoV-2）、TCR功能验证（ICS、ELISPOT、杀伤实验）及表位鉴定等多层级实验。
主要模型
TCR转导的J76.8细胞系 TCR转导的原代CD8+ T细胞 T2细胞 人PBMCs及自体CD4+和CD8+ T细胞去除的PBMCs
重点核对
MicroFAST筛选流程：IFN-γ捕获珠、单CD8+ T细胞和APCs顺序加载至OptoSelect 1500芯片NanoPen中 共培养过夜后，阳性NanoPen定义为含有单CD8+ T细胞和IFN-γ捕获珠（内源Cy5和PE信号合并） 阳性NanoPen中的细胞卸载后用于单细胞TCR测序 TCR功能验证：J76.8荧光素酶报告系统、IFN-γ ELISPOT、细胞内细胞因子染色（ICS） 表位鉴定：通过J76.8细胞与肽脉冲的APCs共培养，检测荧光素酶表达上调
摘要
大多数研究仅通过测量T细胞受体（TCR）与肽-主要组织相容性复合体（p-MHC）的结合亲和力来检测和分离抗原特异性CD8+ T细胞，而不考虑T细胞功能。在此，我们提出了一种基于功能的策略，利用Lightning光流控平台筛选抗原特异性CD8+ T细胞，命名为MicroFAST（基于微流控功能的抗原特异性单个T淋巴细胞筛选），适用于有限样本体积。我们通过使用该方法分离靶向已知HLA-A∗02:01限制性表位的人巨细胞病毒（HCMV）特异性CD8+ T细胞来验证该方法。我们最终应用此方法鉴定了多个SARS-CoV-2特异性TCR，这些TCR以识别HLA-B∗35:01限制性TPS表位（TPSGTWLTY）为特征，证明了我们系统的实用性。TCR结合亲和力与其功能性无关。总之，我们开发了一种在有无肽-MHC特异性先验知识的情况下分离抗原特异性功能性CD8+ T细胞的工作流程，这将促进工程化TCR-T疗法和基于T细胞的疫苗的开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在不依赖肽-MHC特异性先验知识的情况下，分离和鉴定抗原特异性功能性CD8+ T细胞及其TCR？
- 核心机制
- 基于IFN-γ分泌的功能性筛选，在单细胞水平上检测CD8+ T细胞的激活，从而识别功能性TCR，且TCR结合p-MHC的亲和力与其功能性无关。
- 主要证据
- 通过MicroFAST从健康供者中分离出HCMV NLV表位特异性TCR（Pen998），并通过TCR转导、荧光素酶报告、ELISPOT和ICS验证其功能；从COVID-19恢复期供者中筛选出SARS-CoV-2特异性TCR（Pen346等），并鉴定其表位为HLA-B∗35:01限制性TPSGTWLTY。
- 研究意义
- 该工作流程有助于开发工程化TCR-T疗法和基于T细胞的疫苗，尤其是针对慢性感染和癌症。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证已知表位抗原特异性CD8+ T细胞
评估MicroFAST能否从健康供者中分离HCMV NLV表位特异性功能性CD8+ T细胞
对5名健康供者的PBMCs进行NLV表位特异性短时扩增，然后富集CD8+ T细胞，与NLV肽脉冲的T2细胞共培养，进行MicroFAST筛选，并从阳性NanoPen中导出细胞进行TCR测序。
筛选未知表位SARS-CoV-2特异性CD8+ T细胞
评估MicroFAST能否在没有肽-MHC特异性先验知识的情况下，从恢复期供者中分离SARS-CoV-2特异性功能性CD8+ T细胞
从一名SARS-CoV-2感染恢复期供者PBMCs中，用肽池扩增T细胞（N肽池等），富集CD8+ T细胞，与自体CD4+和CD8+ T细胞去除的PBMCs共培养，进行MicroFAST筛选，并从阳性NanoPen中导出细胞进行TCR测序。
表位鉴定
确定MicroFAST筛选出的SARS-CoV-2特异性TCR所识别的精确表位和限制性HLA等位基因
将编码TCR的质粒转导至J76.8细胞，通过荧光素酶报告实验和CD69上调检测不同肽段诱导的激活，确定表位为TPSGTWLTY；通过转染HLA等位基因的K562细胞确定限制性为HLA-B∗35:01。
功能验证
评估MicroFAST筛选出的SARS-CoV-2特异性TCR的功能性，包括细胞因子分泌、脱粒和细胞毒性
将TCR转导至原代T细胞，与自体LCLs（脉冲的靶肽或对照）共培养，通过细胞内细胞因子染色检测IFN-γ、TNF-α和CD107a；与TPS肽脉冲的K562-B∗35:01细胞共培养，评估细胞毒性。
评估TCR结合亲和力与功能性相关性
比较TCR与p-MHC多聚体的结合亲和力与其在T细胞中的功能性之间的关系
用HLA-B∗35:01/TPS Dextramer染色，比较不同TCR的亲和力；通过ICS检测转导TCR的原代T细胞的功能性，并进行Pearson相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 61870036 |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| IMDM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141C | |
| 人血清 | GeminiBio | 100-512 | |
| GT-T551 H3培养基 | TAKARA | WK593S | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| HEPES | Gibco | -- | |
| B-27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| PBMC分离 | Ficoll-Paque™ plus | Cytiva | 17144002 |
| 细胞因子 | 人IL-7 | Peprotech | 200-07-100UG |
| 人IL-2 | Peprotech | 200-02-50UG | |
| T细胞刺激 | T细胞TransACT | Miltenyi | 130-111-160 |
| 表位鉴定 | 合成肽 | GenScript | -- |
| β2-微球蛋白 | Sino Biological | 11976-H08H | |
| 药物处理 | 环孢素A | MCE | HY-B0579 |
| 转染 | PEI转染试剂 | Polysciences | 24885-2 |
| 逆转录病毒感染 | Retronectin | TAKARA | T100A |
| 抗体 | CD3单克隆抗体（OKT3） | Invitrogen | 16-0037-85 |
| 抗人CD28抗体 | Biolegend | 302923 | |
| IFN-γ检测抗体 | Biolegend | 740282 | |
| 流式抗体 | BUV805 小鼠抗人CD3（克隆SK7） | BD Biosciences | 612893 |
| BUV737 小鼠抗人CD8（克隆RPA-T8） | BD Biosciences | 749367 | |
| BB700 小鼠抗人CD4（克隆SK3） | BD Biosciences | 566392 | |
| APC 小鼠抗人TCR αβ（克隆T10B9.1A-31） | BD Biosciences | 563826 | |
| PE-Cy7 小鼠抗人CD69（克隆FN50） | BD Biosciences | 557745 | |
| APC 小鼠抗人IFN-γ（克隆B27） | BD Biosciences | 562017 | |
| APC/Cy7 抗人CD8a（克隆HIT8a） | Biolegend | 300926 | |
| APC/Cy7 抗人IL-2（克隆MQ1-17H12） | Biolegend | 500342 | |
| PE 抗人CD3（克隆SK7） | Biolegend | 981004 | |
| PE/Dazzle™ 594 抗人TNF-α（克隆MAb11） | Biolegend | 502946 | |
| PE/Cy7 抗人CD107a（LAMP-1）（克隆H4A3） | Biolegend | 328618 | |
| BV421 抗人CD8（克隆SK1） | Biolegend | 344748 | |
| 细胞活性 | BV510/eFluor506可固定活力染料 | eBioscience | 65-0866-14 |
| DRAQ7™试剂 | Biolegend | 424001 | |
| 细胞增殖 | CellTrace™ violet | Invitrogen | C34557 |
| 刺激 | PMA/离子霉素 | Biolegend | 423301 |
| 细胞因子检测 | 布雷菲德菌素A溶液 | Biolegend | 420601 |
| ELISPOT | 人IFN-γ ELISPOTpro试剂盒 | Mabtech | 3420-2AST-10 |
| 荧光素酶检测 | Bio-Lite荧光素酶检测系统 | Vazyme | DD1201-03 |
| 芯片 | Lightning OptoSelect™ 1500芯片（含润湿液） | Berkeley Lights | 750-00060 |
| 润湿添加剂 | Berkeley Lights | 750-08091 | |
| 冲洗芯片 | Berkeley Lights | 500-00030 | |
| 芯片清洗 | BLI清洗液 | Berkeley Lights | 520-08000 |
| IFN-γ捕获 | IFN-γ捕获珠 | Biolegend | 740276 |
| RNA纯化 | Agencourt RNAClean XP磁珠 | Beckman Coulter | A63987 |
| RT-PCR | 一步法RT-PCR试剂盒 | Qiagen | 210212 |
| PCR | Q5热启动高保真2×预混液 | NEB | M0494L |
| T细胞分选 | CD8+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-096-495 |
| CD3微磁珠 | Miltenyi | 130-050-101 | |
| 细胞内染色 | BD Cytofix/Cytoperm™固定/破膜试剂盒 | BD Biosciences | 554714 |
| 克隆 | pEASY-Blunt Simple克隆载体 | TransGen | CB111-01 |
| 多聚体染色 | HLA-B∗35:01/TPSGTWLTY/Dextramer-PE | ImmuDex | WK057590XG |
| HLA-A∗02:01 CMV pp65四聚体-PE | MBL | TS-0010-1C |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本制备 | PBMCs分离方法（Ficoll密度梯度离心）；细胞培养基（RPMI-1640或GT-T551 H3含10%人血清、2% HEPES、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素） 阅读提示：STAR Methods：Human participants 和 Cell lines |
| T细胞扩增 | 肽池或单肽浓度（2.5 μg/ml）；IL-7浓度（20 ng/ml）和IL-2浓度（20 U/ml）；扩增时间（3天+9天） 阅读提示：STAR Methods：T cell lines (TCLs) and LCLs preparation |
| MicroFAST操作 | 芯片类型（OptoSelect 1500）；IFN-γ捕获珠、单CD8+ T细胞和APCs的加载顺序和体积；共培养时间（过夜）；染色和成像条件（曝光时间：Cy5 2000 ms, PE 800 ms, FITC 4000 ms, DAPI 1000 ms） 阅读提示：STAR Methods：Lightning™ operation |
| TCR测序 | RNA提取和纯化方法（Agencourt RNAClean XP Beads）；RT-PCR和多重PCR条件（One-Step RT-PCR kit, Q5 Hot Start High Fidelity 2× Master Mix）；引物序列（TRAC-seq, TRBC-seq, C25-P1, C25-P2等） 阅读提示：STAR Methods：Single-cell sequencing and analysis |
| 表位鉴定 | J76.8细胞与APCs共培养比例（1:1）；肽浓度（5 μg/ml）；共培养时间（8小时）；荧光素酶检测试剂（Bio-Lite Luciferase Assay System） 阅读提示：STAR Methods：Luciferase assay |