验证hsa_circRNA_0101125的亚细胞定位及基因表达
确定hsa_circRNA_0101125在细胞内的定位，并比较相关基因在两种细胞系中的基础表达水平。
使用FISH检测hsa_circRNA_0101125在KYSE150和ECA109细胞中的定位；通过RT-qPCR检测hsa_circRNA_0101125、miR-143-3p、ZEB1、ZHX3和ZNF148的表达。
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Hsa_circRNA_0101125通过miR-143-3p/ZNF148轴促进食管鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭
Hsa_circRNA_0101125 Promotes Proliferation, Migration, and Invasion of Esophageal Squamous Cell Carcinoma via miR-143-3p/ZNF148 Axis.
实验完整度
中本研究包含细胞系模型、分子机制验证（双荧光素酶）和功能实验（CCK-8、划痕、Transwell），但缺乏动物模型或临床样本验证，实验完整度中等。
主要模型
KYSE150细胞系 ECA109细胞系
重点核对
细胞系：KYSE150和ECA109 转染：sh-hsa_circRNA_0101125载体和miR-143-3p抑制剂，浓度25 nM 检测时间：转染后48小时 CCK-8实验：每孔1×10^4细胞，检测24h和48h Transwell实验：每孔1×10^5细胞，基质胶稀释1:6
摘要
食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种高度侵袭和转移的恶性肿瘤。环状RNA（circRNAs），包括hsa_circRNA_0101125，已被认为在调节癌症转移中发挥作用。但其在ESCC中的潜在作用仍未充分探索，特别是与miR-143-3p的关系。本研究旨在探讨hsa_circRNA_0101125/miR-143-3p在ESCC发生发展中的作用。以KYSE150和ECA109细胞作为体外模型，评估hsa_circRNA_0101125的生物学效应。通过双荧光素酶实验证实ZNF148与miR-143-3p之间的相互作用。为了评估该通路的功能作用，用sh-hsa_circRNA_0101125载体和/或miR-143-3p抑制剂转染细胞，然后进行细胞活力（CCK-8）、迁移（划痕愈合实验）和侵袭（Transwell实验）检测。通过RT-qPCR和western blot检测hsa_circRNA_0101125、miR-143-3p和ZNF148的转录和表达。结果显示，hsa_circRNA_0101125定位于细胞质，负调控miR-143-3p，后者靶向ZNF148。抑制hsa_circRNA_0101125可显著降低细胞活力、迁移和侵袭，下调ZNF148和Vimentin，上调miR-143-3p和E-cadherin表达。相反，下调miR-143-3p可消除这些效应。因此，hsa_circRNA_0101125通过抑制miR-143-3p的表达促进ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- hsa_circRNA_0101125是否通过miR-143-3p调控ZNF148促进食管鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭？
- 核心机制
- hsa_circRNA_0101125作为ceRNA海绵吸附miR-143-3p，解除其对ZNF148的抑制，上调ZNF148表达，进而促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭。
- 主要证据
- 在KYSE150和ECA109细胞中，敲低hsa_circRNA_0101125后miR-143-3p表达升高，ZNF148蛋白下调，细胞活力、迁移和侵袭能力降低；双荧光素酶实验证实miR-143-3p与ZNF148的结合；miR-143-3p抑制剂逆转了敲低效应。
- 研究意义
- 本研究揭示了hsa_circRNA_0101125/miR-143-3p/ZNF148轴在ESCC进展中的作用，可能为ESCC提供新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
敲低hsa_circRNA_0101125并检测功能表型
评估敲低hsa_circRNA_0101125对细胞增殖、迁移和EMT标志物表达的影响。
用sh-hsa_circRNA_0101125转染细胞，通过CCK-8、划痕愈合实验和Western blot检测细胞活力和迁移能力及EMT相关蛋白表达。
验证miR-143-3p与ZNF148的靶向结合
通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-143-3p是否直接靶向ZNF148的3'UTR。
将野生型或突变型ZNF148 3'UTR克隆到pmirGLO载体，与miR-143-3p mimic或阴性对照共转染至KYSE150和ECA109细胞，检测荧光素酶活性。
验证miR-143-3p抑制剂对敲低效应的逆转
确认miR-143-3p在hsa_circRNA_0101125介导的功能中的作用。
将miR-143-3p抑制剂与sh-hsa_circRNA_0101125共转染，检测细胞活力、迁移、侵袭及EMT相关蛋白表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证模型特征或亚细胞定位
验证细胞功能变化
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 原位杂交 | hsa_circRNA_0101125原位杂交试剂盒 | Boster | MK11075-h |
| Cy3荧光抗体 | Boster | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | KeyGen Biotech | KGM31800S |
| 嘌呤霉素 | Solarbio | P8230 | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L3000001 |
| P3000试剂 | Thermo Fisher | L3000001 | |
| miR-143-3p模拟物 | General Biol (Anhui) Co. LTD | -- | |
| miR-143-3p抑制剂 | General Biol (Anhui) Co. LTD | -- | |
| CCK-8实验 | CCK-8细胞增殖检测试剂盒 | KeyGEN BioTECH | KGA317 |
| Transwell侵袭实验 | 基质胶 | BD Biosciences | 356234 |
| 双荧光素酶实验 | pmirGLO双荧光素酶载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | CWBIO | CW0580S |
| RNA超纯提取试剂盒 | CWBIO | CW0581M | |
| miRNA超纯提取试剂盒 | CWBIO | CW0627S | |
| PrimeScriptTM RT试剂盒 | Takara Medical Technology | RR047A | |
| miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme Biotech | MR201-01 | |
| CFX Connect实时荧光PCR检测系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Western blot | RIPA细胞裂解液 | ApplyGen | C1053 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Elabscience | E-BC-K318-M | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 兔抗ZNF148抗体 | Affinity | AF0792 | |
| 小鼠抗Vimentin抗体 | Proteintech | 60330-1-Ig | |
| 兔抗E-钙黏蛋白抗体 | Affinity | AF0131 | |
| 小鼠抗β-肌动蛋白抗体 | TransGen Biotech | HC201 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L） | Servicebio | GB23301 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Servicebio | GB23303 | |
| 化学发光液 | Thermo Fisher | RJ239676 | |
| 细胞培养 | KYSE-150细胞系 | Procell | CL-0737 |
| ECA-109细胞系 | BeNa Culture Collection | BNCC342591 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源和培养条件（RPMI-1640培养基、10%FBS、37°C、5% CO2）；转染试剂Lipofectamine 3000和P3000；工作浓度：miRNA mimic和inhibitor均为25 nM；转染后培养48小时。 阅读提示：Materials and Methods部分2.2节 |
| CCK-8实验 | 细胞接种密度：1×10^4细胞/孔；检测时间点：24h和48h；CCK-8试剂孵育时间：2小时；测量波长：450 nm。 阅读提示：Materials and Methods部分2.3节 |
| 划痕愈合实验 | 细胞接种密度：1×10^6细胞/孔；划痕工具：200 μL移液枪头；检测时间点：0h、24h、48h。 阅读提示：Materials and Methods部分2.4节 |
| Transwell侵袭实验 | Transwell孔径8 μm；基质胶稀释比例1:6，包被体积60 μL；细胞接种密度：1×10^5细胞/孔；下室含10% FBS；固定和染色条件。 阅读提示：Materials and Methods部分2.5节 |
| 双荧光素酶实验 | 报告载体pmirGLO WT/MUT ZNF148 3'UTR；共转染的miRNA mimic浓度25 nM；转染后48小时检测；荧光素酶活性归一化至Renilla。 阅读提示：Materials and Methods部分2.6和2.7节 |
| RT-qPCR | 内参基因：β-actin和U6；反转录条件（25°C 5min, 50°C 15min, 85°C 5min）；PCR循环参数：预变性95°C 10min；40循环（95°C 10s, 58°C 30s, 72°C 30s）。 阅读提示：Materials and Methods部分2.8节 |
| Western blot | 抗体稀释比例：ZNF148、Vimentin、E-cadherin均为1:1000，β-actin为1:2000；封闭条件：3%脱脂牛奶1小时；二抗孵育2小时；内参蛋白：β-actin（但结果中部分图注以β-actin归一化，需核对）。 阅读提示：Materials and Methods部分2.9节及图注 |