EVs的提取与表征
获取并验证M. bovis NX2感染的MAC-T细胞来源的EVs及未感染的对照EVs，确保其质量和纯度。
利用超速离心法从MAC-T细胞培养上清中提取EVs，通过TEM、DLS、Western blotting及BCA分析表征其形态、大小、标志蛋白和浓度，并通过PPLO培养和PCR验证无M. bovis NX2污染。
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牛支原体感染的牛乳腺上皮细胞释放的细胞外囊泡的综合多组学分析鉴定了诱导巨噬细胞炎症反应的蛋白质和miRNA
Comprehensive multiomic analysis of extracellular vesicles from Mycoplasma bovis-infected bovine mammary epithelial cells identifies proteins and miRNAs that induce inflammatory responses in macrophages.
实验完整度
高包含体外细胞模型（MAC-T、BoMacs、BMDMs、原代巨噬细胞），功能验证（炎症因子表达）、转录组和蛋白质组及miRNA组学分析，以及多模型验证。
主要模型
MAC-T细胞（牛乳腺上皮细胞） BoMacs（牛巨噬细胞系） 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） 牛外周血单核细胞来源巨噬细胞
重点核对
M. bovis NX2感染MAC-T细胞的MOI为10 EV处理巨噬细胞的浓度为50 μg/mL BoMacs经内吞和巨胞饮抑制剂预处理（heparin 20 μg/mL, Dynasore 25 μM, amiloride 0.25 mM, chlorpromazine 5 μM, EIPA 40 μM）后与DID标记EVs孵育12小时 EV提取后通过PPLO培养和PCR验证无M. bovis NX2污染，并检测NOX蛋白确认无M. bovis来源蛋白 BMDMs和牛单核细胞来源巨噬细胞的纯度验证（CD11b或CD14标记>95%）
摘要
牛支原体可导致牛奶质量和产量下降，从而在全球范围内造成显著的经济损失。细胞外囊泡（EVs）对于触发免疫细胞对感染的反应至关重要。本研究旨在证明被牛支原体感染的牛乳腺上皮细胞（MAC-T细胞）释放的EVs对牛巨噬细胞（BoMacs）的免疫调节作用。从被牛支原体感染的MAC-T细胞（M. bovis NX2-EVs）以及未感染的MAC-T细胞（Ctrl-EVs）中提取EVs后，将其与BoMacs孵育，以评估其诱导细胞因子表达的能力。结果表明，经M. bovis NX2-EVs处理的BoMacs中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达显著增加。此外，差异表达基因主要涉及TNF、NF-kappa B和IL-17信号通路，其中内吞和巨胞饮被确认为BoMacs摄取EVs的主要途径。此外，利用质谱和RNA-seq确定了Ctrl-EVs和M. bovis NX2-EVs的蛋白质和miRNA表达谱。与Ctrl-EVs相比，M. bovis NX2-EVs中分别有27个和86个蛋白质显著下调和上调。类似地，M. bovis NX2-EVs中总共有9个miRNA上调，2个miRNA下调。最后，JCHAIN、MAPRE1、miR-1307和miR-149-5p被鉴定为M. bovis NX2-EVs中的差异表达蛋白质和miRNA，从而强调了它们在细胞免疫调节和相关疾病中的作用。这些结果揭示了宿主抵抗M. bovis感染的机制，并为探索M. bovis的致病机制提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 牛支原体感染的牛乳腺上皮细胞释放的细胞外囊泡是否能够诱导巨噬细胞产生炎症反应，以及其分子机制是什么？
- 核心机制
- M. bovis NX2-EVs通过内吞和巨胞饮途径被BoMacs摄取，激活NF-kappa B、TNF、IL-17等炎症信号通路，并通过携带的差异蛋白（如JCHAIN、MAPRE1）和miRNA（如miR-1307、miR-149-5p）调控炎症反应。
- 主要证据
- M. bovis NX2-EVs处理后，BoMacs、BMDMs和牛单核细胞来源巨噬细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎细胞因子表达升高；转录组分析显示DEGs富集于NF-kappa B等通路；蛋白质组学、miRNA测序及qPCR验证了差异分子。
- 研究意义
- 该研究揭示了宿主抵抗M. bovis感染的机制，为探索M. bovis的致病机制提供了新的见解，可能对理解牛支原体乳腺炎的发病机制有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
EVs摄取机制分析
确定BoMacs摄取MAC-T来源EVs的主要途径。
用DID标记EVs并与BoMacs孵育，通过共聚焦显微镜观察内化情况；用内吞和巨胞饮抑制剂预处理后，通过流式细胞术检测EVs摄取效率。
炎症反应评估
检测M. bovis NX2-EVs对巨噬细胞炎症细胞因子表达的影响。
将BoMacs、BMDMs和牛单核细胞来源巨噬细胞与Ctrl-EVs或M. bovis NX2-EVs孵育，通过Western blotting、qRT-PCR和免疫荧光检测TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的表达。
转录组分析
分析M. bovis NX2-EVs处理BoMacs后的差异表达基因，并确定涉及的信号通路。
对Ctrl-EVs和M. bovis NX2-EVs处理12和24小时后的BoMacs进行RNA-seq，利用DESeq2分析差异表达基因，并进行GO和KEGG富集分析，GSEA分析相关通路。
蛋白质组学分析
鉴定M. bovis NX2-EVs与Ctrl-EVs之间差异表达的蛋白质。
通过LC-MS/MS和质谱分析EVs蛋白质组，鉴定差异蛋白并进行亚细胞定位、GO和KEGG富集分析。
miRNA谱分析
鉴定M. bovis NX2-EVs与Ctrl-EVs之间差异表达的miRNA。
提取EVs中的RNA，进行小RNA测序，利用edgeR分析差异表达miRNA，并通过qRT-PCR验证特定miRNA的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 菌株培养 | PPLO培养基 | BD Company | -- |
| 马血清 | HyClone | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM/F-12培养基 | Pricella | -- | |
| 胎牛血清 | Pricella | -- | |
| 细胞活力检测 | MTT检测试剂盒 | -- | -- |
| EV提取和定量 | 去外泌体胎牛血清 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| EV表征 | 纳米粒径和Zeta电位分析仪 | Anton Paar | -- |
| HT7700透射电子显微镜 | Hitachi | -- | |
| EV荧光标记和摄取 | DID | Invitrogen | -- |
| 共聚焦显微镜 | Leica | TCS SP8 | |
| 流式细胞仪 | Sony | MA900 | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 上样缓冲液 | Takara Bio | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗TSG101抗体 | ProteinTech | -- | |
| 抗钙联蛋白抗体 | ProteinTech | -- | |
| 抗TNF-α抗体 | ProteinTech | -- | |
| 抗TNF-α（小鼠）抗体 | ABclonal | -- | |
| 抗NOX抗体 | -- | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | ProteinTech | -- | |
| 抗CD63抗体 | System Biosciences | -- | |
| 抗CD81抗体 | System Biosciences | -- | |
| 抗ARCN1抗体 | ProteinTech | -- | |
| 抗MAPRE1抗体 | Affinity | -- | |
| 抗APLP2抗体 | ProteinTech | -- | |
| 抗JAG1抗体 | ProteinTech | -- | |
| 抗JCHAIN抗体 | AtaGenix | -- | |
| HRP标记的亲和纯化山羊抗小鼠IgG（H+L） | ProteinTech | -- | |
| HRP标记的亲和纯化山羊抗兔IgG（H+L） | ProteinTech | -- | |
| 化学发光试剂盒 | Advansta | -- | |
| Amersham Imager 600成像仪 | Cytiva | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA去除） | Vazyme | -- | |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| 引物 | Sango Biotechnology | -- | |
| 免疫荧光染色 | 抗TNF-α抗体 | Proteintech | -- |
| 抗IL-1β抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗IL-6抗体 | Affinity | -- | |
| Alexa Fluor 594偶联的山羊抗兔IgG（H+L） | Thermo Fisher | -- | |
| Alexa Fluor 488偶联的山羊抗小鼠IgG（H+L） | Thermo Fisher | -- | |
| DAPI | Thermo Fisher | -- | |
| Hoechst染料 | Beyotime | -- | |
| BMDMs制备 | 低糖DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 小鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） | MCE | -- | |
| 胰蛋白酶 | Invitrogen | -- | |
| 牛PBMC分离和巨噬细胞分化 | 牛外周血单核细胞分离试剂盒 | Solarbio | -- |
| 红细胞裂解液 | Beyotime | -- | |
| EDTA | Beyotime | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胰岛素 | MCE | -- | |
| 牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF） | MCE | -- | |
| 流式细胞术 | FITC偶联的抗CD11b抗体 | Proteintech | -- |
| FITC偶联的抗CD14抗体 | Bio-Rad | -- | |
| RNA-seq | Qubit 2.0荧光计 | -- | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| 蛋白质组学 | Astral质谱仪 | -- | -- |
| CELLO软件 | -- | -- | |
| Blast2Go软件 | -- | -- | |
| KOBAS软件 | -- | -- | |
| 免疫金电子显微镜 | 镍网 | -- | -- |
| 碳膜 | -- | -- | |
| 10nm金颗粒标记的抗兔IgG二抗 | AURION | -- | |
| 10nm金颗粒标记的抗小鼠IgG二抗 | AURION | -- | |
| Tecnai Bio Twin透射电子显微镜 | FEI | -- | |
| AMT CCD相机 | Advanced Microscopy Techniques | -- | |
| EV miRNA测序 | Agilent高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent | -- |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒 | -- | -- | |
| EV miRNA RT-qPCR | miRNeasy迷你试剂盒 | QIAGEN | -- |
| All-in-One miRNA qRT-PCR检测试剂盒2.0 | GeneCopoeia | -- | |
| 统计 | GraphPad Prism 6.0软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株培养 | M. bovis NX2菌株的培养基、血清类型、培养温度和CFU测定条件 阅读提示：参见Materials and methods, Strain culture |
| 细胞培养 | MAC-T和BoMacs的培养条件（培养基、温度、CO2浓度）、FBS浓度、抗生素浓度 阅读提示：参见Materials and methods, Cell culture |
| 细胞活力 | MTT实验的细胞密度、MOI范围（5-100）、孵育时间（24h）、MTT溶液用量、溶解和测量波长 阅读提示：参见Materials and methods, Cell viability assay |
| EV提取 | 细胞接种密度、感染MOI（10）、感染时间、超速离心步骤、膜过滤、P70AT转子、BCA定量 阅读提示：参见Materials and methods, Extraction and quantification of EVs |
| EV表征 | NTA稀释比例、TEM负染色条件、EV标志物分析（CD63等） 阅读提示：参见Materials and methods, Nanoparticle tracking analysis; Transmission electron microscopy; Western blotting |
| EV摄取 | DID标记浓度（1:200）、EV浓度（50 μg/mL）、孵育时间（12h）、抑制剂预处理浓度（heparin 20 μg/mL等）、抑制时间（6h） 阅读提示：参见Materials and methods, EV fluorescent labelling and cellular uptake |
| 炎症反应检测 | EV处理浓度（50 μg/mL）、处理时间（12h或24h）、qRT-PCR引物序列、Western blotting抗体浓度 阅读提示：参见Materials and methods, Western blotting; RT-qPCR; Immunofluorescence staining |
| 原代巨噬细胞制备 | 小鼠周龄、M-CSF浓度（20 ng/mL）、培养时间（7天）、牛PBMC分离方法和分化因子（GM-CSF 20 ng/mL） 阅读提示：参见Materials and methods, Preparation of BMDMs; Isolation of bovine PBMCs and differentiation into macrophages |
| 转录组分析 | 处理时间（12h和24h）、细胞密度、RNA提取试剂、测序平台、差异表达分析方法和阈值 阅读提示：参见Materials and methods, RNA-seq and genome-wide transcriptome analysis |
| 蛋白质组分析 | 样本分组（每组3个）、LC-MS/MS模式（DIA）、差异蛋白筛选阈值（p<0.05, FC>1.5） 阅读提示：参见Materials and methods, LC-MS/MS and proteomic analysis |
| miRNA分析 | EV miRNA提取试剂盒、测序平台、差异miRNA筛选阈值（p<0.05, log2FC>1）、qRT-PCR验证引物 阅读提示：参见Materials and methods, Sequencing of EV-derived miRNAs; EV-derived miRNA RT-qPCR |