HBV-circRNA-5的鉴定与表征
验证HBV-circRNA-5在HBV相关HCC组织和细胞中的存在、环化结构、定位和稳定性。
通过RT-qPCR和Sanger测序检测HBV-circRNA-5在HBV阳性HCC组织和HepG2.2.15细胞中的表达；通过FISH和亚细胞分级实验检测其定位；通过RNase R处理评估其稳定性。
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HBV编码的circRNA-5通过调控miR-9-3p/Hippo信号轴促进肝细胞癌进展
HBV-encoded circRNA-5 promotes hepatocellular carcinoma progression by regulating the miR-9-3p/Hippo signaling axis.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内裸鼠成瘤实验、双荧光素酶报告基因、Western blot等多项独立实验验证
主要模型
HepG2.2.15细胞 Hep3B细胞 SMMC-7721细胞 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
HBV-circRNA-5过表达质粒和siRNA的转染效率（RT-qPCR验证） 细胞计数：CCK-8实验每孔2500个细胞 transwell迁移/侵袭实验细胞数：1×10^5 体内实验：Hep3B细胞1×10^7每只注射至裸鼠皮下 miR-9-3p mimics和YAP/TAZ抑制剂的使用浓度
摘要
慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染被认为是最严重的传染病之一，也是一个重大的全球公共卫生问题。尽管新生儿疫苗能有效阻止HBV的传播，但数千万HBV患者仍易患肝病甚至肝细胞癌（HCC）。在本研究中，我们证明了HBV编码的circRNA，命名为HBV-circRNA-5，参与HCC的肿瘤发生。HBV-circRNA-5的过表达在体外促进HCC细胞增殖和转移，并在体内促进HCC肿瘤生长。机制上，HBV-circRNA-5选择性结合miR-9-3p，导致YAP/TAZ表达上调，从而刺激HCC增殖。总之，我们为理解HBV介导的HCC的癌变和进展提供了新的见解，并阐明了HBV通过HBV-circRNA-5/miR-9-3p/Hippo网络促进HCC进展的新细胞机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HBV编码的circRNA HBV-circRNA-5是否参与以及如何促进肝细胞癌的进展？
- 核心机制
- HBV-circRNA-5作为miR-9-3p的海绵，上调YAP/TAZ表达，从而激活Hippo信号通路，促进HCC增殖。
- 主要证据
- 体外功能实验（CCK-8、克隆形成、EdU、Transwell）显示HBV-circRNA-5促进HCC增殖、侵袭和迁移；体内裸鼠实验显示其促进肿瘤生长；双荧光素酶报告实验验证了与miR-9-3p的直接结合；Western blot显示YAP/TAZ蛋白水平变化。
- 研究意义
- 揭示了HBV相关HCC发展的分子机制，为HCC治疗提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HBV-circRNA-5功能缺失实验
评估敲低HBV-circRNA-5对HBV阳性HCC细胞恶性表型的影响。
使用靶向剪接位点的siRNA敲低HBV-circRNA-5表达，通过RT-qPCR验证敲低效率，并进行CCK-8、克隆形成和EdU实验检测细胞增殖。
HBV-circRNA-5过表达功能实验
评估过表达HBV-circRNA-5对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
将HBV-circRNA-5全长序列克隆到表达载体并转染细胞，通过CCK-8、克隆形成、EdU和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。
miRNA海绵机制验证
验证HBV-circRNA-5是否直接结合miR-9-3p并发挥海绵作用。
利用VirusCircBase和RNAhybrid预测结合位点；构建野生型和突变型HBV-circRNA-5荧光素酶报告载体，与miR-9-3p共转染HEK-293T细胞进行双荧光素酶报告实验；RT-qPCR检测miR-9-3p表达；通过miR-9-3p mimics挽救实验和circRNA-5突变体实验验证功能。
Hippo信号通路机制验证
验证HBV-circRNA-5通过miR-9-3p调控Hippo通路关键蛋白YAP/TAZ的表达。
通过Western blot检测miR-9-3p mimics、HBV-circRNA-5过表达或敲低后YAP/TAZ蛋白水平；使用YAP/TAZ抑制剂YTI处理，通过CCK-8检测细胞增殖。
体内成瘤实验
验证HBV-circRNA-5在体内对肿瘤生长的影响。
将稳定表达HBV-circRNA-5的Hep3B细胞皮下注射到BALB/c裸鼠，监测肿瘤体积和重量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| EMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| RNA提取 | TransZol试剂 | Transgen | -- |
| cDNA合成 | cDNA合成试剂 | YEASEN | -- |
| miRNA逆转录 | miRNA试剂 | Vazyme | -- |
| RT-qPCR | Hieff qPCR预混液 | YEASEN | -- |
| 实时荧光定量PCR系统 | ThermoFisher | -- | |
| 细胞转染 | TransIntro EL转染试剂 | Transgen | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | MedChemExpress | -- |
| EdU检测 | EdU-594试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNase R处理 | RNase R | GENESEED | -- |
| FISH | DIG标记探针 | GENERAL BIOL | -- |
| Western blot | 裂解试剂 | Beyotime | -- |
| Easy II蛋白定量试剂盒（BCA） | -- | -- | |
| 5× SDS-PAGE上样缓冲液 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗TAZ抗体 | CST | #83669 | |
| 抗YAP抗体 | CST | #14074 | |
| 抗β-actin抗体 | CST | #4970 | |
| 二抗 | Transgene | HS101-01 | |
| 双荧光素酶报告 | pmirGLO载体 | PROMEGA | Addgene_212613 |
| 荧光素酶试剂盒 | YEASEN | -- | |
| 细胞培养 | HepG2细胞 | -- | RRID:CVCL_0027 |
| Hep3B细胞 | -- | RRID:CVCL_0326 | |
| HepG2.2.15细胞 | -- | RRID:CVCL_L855 | |
| SMMC-7721细胞 | -- | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Spfbiotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基种类、血清浓度、培养温度 阅读提示：Methods - Cell culture |
| 细胞转染 | 转染试剂、质粒或siRNA浓度、转染时间 阅读提示：Methods - Cell transfection |
| 增殖检测 | 细胞接种密度、检测时间点、CCK-8孵育时间 阅读提示：Methods - Cell counting kit-8 proliferation assay |
| 迁移/侵袭检测 | 细胞数、Matrigel使用、孵育时间、固定和染色条件 阅读提示：Methods - Cell invasion and migration assays |
| EdU检测 | EdU浓度、孵育时间、Click反应时间 阅读提示：Methods - EdU assay |
| 克隆形成 | 细胞接种数、培养时间、染色方法 阅读提示：Methods - Colony formation assay |
| RNase R处理 | RNA量（3μg）、处理时间（8-10分钟）、温度（37°C） 阅读提示：Methods - RNase R treatment |
| FISH | 探针序列、杂交温度和时间、洗涤条件 阅读提示：Methods - FISH assay |
| Western blot | 抗体稀释度、孵育时间、蛋白上样量 阅读提示：Methods - Western blot |
| 动物实验 | 小鼠品系、细胞注射数量（1×10^7）、肿瘤体积测量公式 阅读提示：Methods - Animal experiment |
| 双荧光素酶报告 | 质粒（WT和MUT）构建、共转染细胞系、检测方法 阅读提示：Methods - Dual-luciferase reporter assays |
| 统计 | 统计方法、显著性阈值 阅读提示：Methods - Statistical analysis |