评估NU6300对NLRP3炎症小体活化的抑制作用
检测NU6300能否抑制经典和非经典炎症小体介导的IL-1β释放。
在LPS刺激的THP-1细胞和BMDMs中，用不同刺激物（nigericin、ATP、Alum、MSU等）活化炎症小体，检测IL-1β分泌。
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NU6300对Keap1 Cys489的共价修饰激活Nrf2信号并抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡
Covalent modification of Keap1 Cys489 by NU6300 activates Nrf2 signaling and suppresses NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis.
实验完整度
高包含体外细胞模型（THP-1、BMDMs）、HEK-293T转染实验、分子互作分析（SPR、DARTS、CETSA）及体内小鼠模型等多层级验证，涵盖功能验证和机制验证。
主要模型
THP-1细胞 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） APAP诱导的急性肝损伤小鼠模型
重点核对
THP-1细胞需PMA分化，LPS（1 μg/mL）预处理3 h，NU6300预处理40 min，尼日利亚霉素（10 μM）刺激35 min Keap1点突变（C489A等）在HEK-293T细胞中的过表达验证共价修饰位点 SPR分析中NU6300与Keap1结合的KD为200 nM，与Kelch结构域结合的KD为153 nM 小鼠模型：C57BL/6J雄性，APAP剂量450 mg/kg腹腔注射，NU6300剂量2.5、5、10 mg/kg
摘要
核因子E2相关因子2（Nrf2）是氧化应激和炎症小体的主要调节因子，在调节细胞焦亡中起关键作用。在本研究中，我们将NU6300鉴定为一种新型Nrf2小分子激活剂，其可恢复线粒体功能、减轻氧化应激、抑制炎症小体活化和细胞焦亡。机制上，NU6300共价修饰Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）的半胱氨酸489位点，破坏Keap1-Nrf2相互作用，从而促进Nrf2核转位和抗氧化基因的转录。值得注意的是，NU6300通过氧化还原依赖机制抑制NOD样受体家族pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体活化和gasdermin D（GSDMD）介导的细胞焦亡，这代表了NU6300在Keap1半胱氨酸489位点的共价修饰将Nrf2激活与炎症小体抑制联系起来的第一证据。在体内，NU6300对对乙酰氨基酚（APAP）诱导的小鼠急性肝损伤表现出有效的抗氧化和抗炎保护作用。总之，这些发现表明NU6300是一种新型Nrf2激活剂，为焦亡驱动的炎症性疾病提供了有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NU6300是否通过共价修饰Keap1激活Nrf2信号，从而抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡，并阐明其机制及体内保护作用。
- 核心机制
- NU6300共价修饰Keap1的C489位点，破坏Keap1-Nrf2相互作用，促进Nrf2核转位和抗氧化基因转录，从而抑制NLRP3炎症小体活化和GSDMD介导的细胞焦亡。
- 主要证据
- 体外实验显示NU6300抑制IL-1β释放、保护线粒体功能、激活Nrf2/ARE通路；质谱鉴定C489为共价修饰位点；SPR等证实直接结合；体内APAP诱导肝损伤模型中，NU6300减轻肝损伤、抑制炎症和焦亡。
- 研究意义
- NU6300作为一种新型Nrf2激活剂，为焦亡驱动的炎症性疾病提供了潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测NU6300对线粒体功能的保护作用
探究NU6300对LPS/nigericin诱导的线粒体功能障碍和ROS产生的影响。
使用MitoTracker、JC-1、MitoSOX等染色检测线粒体膜电位和ROS；qPCR检测mtDNA释放；乳酸检测试剂盒评估糖酵解。
验证NU6300对Nrf2信号通路的激活
验证NU6300是否通过激活Nrf2通路增强抗氧化能力并抑制炎症小体活化。
通过蛋白质组学、免疫印迹、亚细胞分级、ARE荧光素酶报告基因、qPCR检测Nrf2及其下游靶基因的表达和活性。
验证NU6300对Keap1的共价修饰及结合位点
确定NU6300是否直接结合Keap1及具体修饰位点。
使用点击化学探针、DARTS、CETSA、TSA、DSF、SPR、LC-MS/MS等方法验证结合，并通过点突变确认C489关键性。
评估NU6300对APAP诱导急性肝损伤的保护作用
检测NU6300在体内对APAP诱导的肝损伤的保护效果。
建立小鼠APAP急性肝损伤模型，给予不同剂量NU6300或NAC，检测血清ALT/AST、组织学、炎症因子、氧化应激指标及NLRP3通路蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与分化 | RPMI 1640培养基 | Procell | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青链霉素 | Gibco | -- | |
| 炎症小体活化 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 三磷酸腺苷 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 尿酸单钠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| poly (dA:dT) | Sigma-Aldrich | -- | |
| 尼日利亚霉素 | Invivogen | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invivogen | -- |
| 荧光染色 | Hoechst 33342 | Invivogen | -- |
| 炎症小体活化 | 鞭毛蛋白 | Enzo Life Sciences | -- |
| 染色 | 吖啶橙 | Solarbio | -- |
| 炎症小体活化 | 氢氧化铝佐剂 | Solarbio | -- |
| 体内模型 | 对乙酰氨基酚 | Solarbio | -- |
| 炎症小体抑制 | MCC950 | TargetMol | -- |
| 炎症小体活化 | Pam3CSK4 | TargetMol | -- |
| 药物处理 | N-乙酰半胱氨酸 | TargetMol | -- |
| Nrf2抑制 | ML385 | TargetMol | -- |
| 点击化学 | 生物素-聚乙二醇3-叠氮化物 | TargetMol | -- |
| 细胞染色 | 碘化丙啶 | Thermo Fisher | -- |
| 线粒体检测 | MitoTracker | Thermo Fisher | -- |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX Red | Thermo Fisher | -- |
| 蛋白处理 | 三(2-羧乙基)膦 | Sangon Biotech | -- |
| Western blot | NLRP3抗体 | Abcam | -- |
| Caspase-1抗体 | AdipoGen | -- | |
| IL-1β抗体 | Affinity Biosciences | -- | |
| ASC抗体 | AdipoGen | -- | |
| Keap1抗体 | Proteintech | -- | |
| GSDMD抗体 | Huabio | -- | |
| Flag抗体 | Huabio | -- | |
| Myc抗体 | Huabio | -- | |
| 泛素抗体 | Huabio | -- | |
| Nrf2抗体 | Abways | -- | |
| NQO1抗体 | Abways | -- | |
| HO-1抗体 | Abways | -- | |
| TRX抗体 | Abways | -- | |
| TXNIP抗体 | Abways | -- | |
| SOD1抗体 | Abways | -- | |
| β-actin抗体 | Abways | -- | |
| Lamin B1抗体 | Abways | -- | |
| NF-κB抗体（总蛋白和磷酸化） | Abways | -- | |
| JAK2抗体（总蛋白和磷酸化） | Abways | -- | |
| STAT3抗体（总蛋白和磷酸化） | Abways | -- | |
| JNK抗体（总蛋白和磷酸化） | Cell Signaling Technology | -- | |
| p38抗体（总蛋白和磷酸化） | Cell Signaling Technology | -- | |
| 质粒构建 | Flag-Keap1质粒 | Addgene | -- |
| pCDNA3-Myc3-Nrf2质粒 | Addgene | -- | |
| mRFP-Ub质粒 | Addgene | -- | |
| p-ARE-luc质粒 | Beyotime | -- | |
| PCR | KOD Plus Neo DNA聚合酶 | Toyobo | -- |
| 克隆 | MonClone™ Hi-Fusion克隆试剂盒V2 | Monad | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | TargetMol | -- |
| 细胞毒性检测 | CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | -- |
| 细胞因子检测 | 人ELISA试剂盒 | 4A Biotech Co., Ltd | -- |
| 小鼠ELISA试剂盒 | Meibiao Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 线粒体检测 | JC-1染料 | Beyotime | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA | Beyotime | -- |
| ASC寡聚化 | DSS（双琥珀酰亚胺辛二酸酯） | -- | -- |
| Western blot | 核浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime | -- |
| RIPA裂解液 | -- | -- | |
| qPCR | RNA裂解液 | TransGen Biotech | -- |
| RNA裂解液 | Accurate Biotechnology | -- | |
| DSF | SYPRO Orange染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SPR | Series S传感器芯片CM5 | Cytiva | BR100530 |
| Biacore T200 | Cytiva | -- | |
| 氧化还原指标 | GSH检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| SOD活性检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| MDA检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 乳酸检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | Beijing HFK Bioscience Co., Ltd. | -- |
| 分子模拟 | PyMOL | -- | -- |
| AutoDock4 | -- | -- | |
| GROMACS 2022.05 | -- | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism v8.1.2 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NLRP3炎症小体活化 | THP-1细胞需PMA分化，LPS（1 μg/mL）预处理3 h，NU6300预处理40 min，尼日利亚霉素（10 μM）刺激35 min 阅读提示：见Materials and methods 2.3 Cell culture and treatment |
| Nrf2激活验证 | NU6300浓度（0.5, 1, 2 μM），处理时间、细胞类型（THP-1, BMDMs, HEK-293T, RAW264.7） 阅读提示：见Results 3.3和3.4，图3、4 |
| Keap1结合及位点验证 | SPR中NU6300与Keap1的KD为200 nM；与Kelch域的KD为153 nM；C489A突变体KD为1.79 μM；需使用纯化蛋白和正确缓冲液 阅读提示：见Materials and methods 2.12-2.16及Results 3.5和4 |
| 体内急性肝损伤模型 | 小鼠品系、性别、年龄、禁食时间、APAP剂量（450 mg/kg）、NU6300剂量（2.5, 5, 10 mg/kg）、NAC剂量（300 mg/kg）、给药方式、取材时间（12 h） 阅读提示：见Materials and methods 2.22及Results 4.1，图7 |