体内和体外缺血再灌注模型建立
模拟缺血再灌注损伤，观察小胶质细胞吞噬功能的变化。
使用 tMCAO/R 小鼠模型和 BV2 细胞 OGD/R 模型。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Chemerin 15 通过 ChemR23/p38 MAPK 通路增强小胶质细胞吞噬作用以减轻脑缺血再灌注损伤
Chemerin 15 enhances microglial phagocytosis to attenuate cerebral ischemia-reperfusion injury through the ChemR23/p38 MAPK pathway.
实验完整度
高研究包含体内（tMCAO 小鼠模型）和体外（BV2 细胞 OGD/R 模型）实验，以及转录组测序，并进行机制（p38 MAPK 抑制剂）和功能验证（吞噬功能、神经功能评估）。
主要模型
BV2 小鼠小胶质细胞 HT-22 小鼠海马神经元 RFP-BV2 小鼠小胶质细胞 C57/BL6J 小鼠 tMCAO/R 模型 小鼠脑组织
重点核对
C15 浓度 500 ng/mL，处理 30 分钟 α-NETA（ChemR23 抑制剂）浓度 100 nM，处理 24 小时 SB203580（p38 MAPK 抑制剂）浓度 50 μM OGD 时间为 3 小时 体内给药剂量：C15 0.3 ng/kg，α-NETA 10 mg/kg，SB203580 5 mg/kg
摘要
小胶质细胞通过吞噬死亡细胞和有害物质，在病理条件下恢复并维持中枢神经系统的稳态。Chemerin 15 (C15) 是一种来源于 chemerin 的肽，是通过 G 蛋白偶联受体 ChemR23 发挥作用的内源性吞噬和炎症调节因子。然而，C15 在缺血再灌注损伤后对小胶质细胞吞噬作用的影响仍不清楚。在此，我们发现在缺血再灌注损伤后，小胶质细胞的吞噬作用被激活并动态改变。C15 给药促进了小胶质细胞对生物颗粒和神经元碎片的吞噬，并上调了吞噬相关基因和通路。此外，C15 与 ChemR23 结合减少了损伤相关分子模式（DAMPs）和 ROS 的产生，并进一步减轻了缺血再灌注损伤后的梗死体积和神经功能缺损。因此，C15 是中风后神经功能恢复的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- C15 是否通过 ChemR23/p38 MAPK 通路调节小胶质细胞吞噬功能，从而减轻脑缺血再灌注损伤？
- 核心机制
- C15 结合 ChemR23 诱导其内化，并激活 p38 MAPK 信号通路，从而增强小胶质细胞的吞噬能力。
- 主要证据
- 体外 OGD/R 模型中 C15 增强 BV2 细胞对 pHrodo Red Zymosan 生物颗粒和 HT-22 神经元碎片的吞噬；体内 tMCAO 模型中 C15 增加 CD68+/IBA1+ 细胞比例及吞噬神经元；转录组测序显示吞噬相关基因和 p38 MAPK 通路被调节。
- 研究意义
- C15 是减轻脑缺血再灌注损伤的潜在治疗靶点，可能有助于卒中后神经功能的恢复。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证 C15 对小胶质细胞吞噬的影响及 ChemR23 依赖性
确定 C15 是否通过 ChemR23 受体增强小胶质细胞吞噬。
BV2 细胞用 C15 和/或 α-NETA 预处理，检测 pHrodo Red Zymosan 吞噬和神经元吞噬（共培养实验）。
转录组测序分析 C15 对吞噬相关基因和通路的影响
鉴定 C15 调节小胶质细胞吞噬的分子机制。
对 OGD、OGD+C15 和 OGD+C15+α-NETA 组进行 mRNA 测序，分析 GO、KEGG 富集和差异表达基因。
验证 p38 MAPK 通路在 C15 促进吞噬中的作用
确定 p38 MAPK 是否为 C15 增强吞噬所需。
使用 p38 MAPK 抑制剂 SB203580，检测吞噬能力以及 p38 MAPK 基因和蛋白表达。
体内验证 C15 通过 ChemR23/p38 MAPK 增强小胶质细胞吞噬
在动物模型中确认 C15 的作用机制。
小鼠 tMCAO 后给予 C15、α-NETA 或 SB203580，通过免疫荧光检测小胶质细胞吞噬神经元。
评估 C15 对脑损伤和神经功能的影响
确定 C15 是否减轻脑缺血再灌注损伤并改善神经功能。
检测梗死体积、神经元损伤、ROS 和 HMGB1 水平，并进行神经功能评分。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖 DMEM 培养基 | Hyclone | SH30243 |
| 胎牛血清 | Corning | 35-179-CV | |
| 0.25% 胰蛋白酶 | Hyclone | SH30042 | |
| OGD 模型 | 无糖 DMEM 培养基 | Gibco | 11966025 |
| 细胞活性检测 | CCK-8 试剂盒 | BOSTER | AR1160 |
| 药物处理 | C15 肽 | Sicierbio Co., Ltd. | -- |
| α-NETA | MCE | -- | |
| SB203580 | MCE | -- | |
| 吞噬实验 | pHrodo Red Zymosan 生物颗粒 | Thermo Fisher Scientific | P35364 |
| 免疫荧光染色 | Hoechst | Thermo Fisher Scientific | 62249 |
| DAPI | -- | BS097 | |
| 抗 Iba1 豚鼠抗体 | Oasis Biofarm | OB-PGP049 | |
| 抗 NeuN 小鼠单克隆抗体 | Abcam | ab279296 | |
| 抗 NeuN 重组兔单克隆抗体 | Huabio | ET1602 | |
| 抗 CD68 兔抗体 | Servicebio | GB113109 | |
| 山羊抗豚鼠 IgG AF647 | Oasis Biofarm | OB-PGP049 | |
| FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L) | Abcam | ab6785 | |
| HRP 过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG (H+L) | Servicebio | GB23303 | |
| iF555-酪胺 | Servicebio | G1233 | |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor 488 标记的小鼠 ChemR23 单克隆抗体 | RD System | FAB7610G |
| Western blot | 抗磷酸化 p38 MAPK (Thr180/Tyr182) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4511T |
| 抗 p38 MAPK 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 8690T | |
| 抗 HMGB1 兔单克隆抗体 | Abcam | ab79823 | |
| 抗 β-肌动蛋白兔单克隆抗体 | BOSTER | BM3873 | |
| 抗 GAPDH 兔单克隆抗体 | ZEN-BIOSCIENCE | R380626 | |
| HRP 标记的山羊抗兔 IgG 抗体 | BOSTER | BA1054 | |
| RNA 提取 | TRIzol 试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018CN |
| RT-qPCR | ExonScript RT SuperMix with dsDNase | Exongen | A502 |
| Fast SYBR Green qPCR Master Mix UDG | Exongen | A402 | |
| RNA-seq | VAHTS Universal V6 RNA-seq 文库制备试剂盒 | Vazyme | NR604 |
| ROS 检测 | 二氢乙锭 | Beyotime | S0063 |
| Nissl 染色 | 尼氏染色试剂盒 | Beyotime Technology | C0117 |
| H&E 染色 | H&E 染色试剂盒 | Biosharp | BL700B |
| 动物实验 | 圆头单丝尼龙线 | Sinon Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：BV2、HT-22、RFP-BV2；培养基：DMEM 高糖 + 10% FBS；传代比例未明确 阅读提示：Methods - Cell culture |
| OGD 模型 | OGD 时间：3 小时；使用无糖 DMEM 培养基；缺氧条件：94% N2, 1% O2, 5% CO2 阅读提示：Methods - Oxygen-glucose deprivation reperfusion (OGD/R) model |
| 体外吞噬实验 | pHrodo Red Zymosan 生物颗粒浓度：5 ng/well；孵育 4 小时；神经元共培养条件 阅读提示：Methods - Phagocytosis test in vitro |
| 药物处理 | C15 浓度：500 ng/mL，处理 30 分钟；α-NETA 浓度：100 nM，处理 24 小时；SB203580 浓度：50 μM 阅读提示：Methods - Grouping and drug administration in vitro |
| 动物模型 | 小鼠品系：C57/BL6J 雄性；年龄：8-10 周；体重：22-25 g；线栓直径：0.20 mm；插入深度：9.5±0.05 mm；阻塞时间：1.5 小时 阅读提示：Methods - Transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion (tMCAO/R) model |
| 体内给药 | C15 剂量：0.3 ng/kg（鼻内）；α-NETA 剂量：10 mg/kg（腹腔）；SB203580 剂量：5 mg/kg（腹腔） 阅读提示：Methods - Transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion (tMCAO/R) model |
| 神经功能评估 | 评估时间点：术前、术后 1 天、3 天、7 天、14 天、28 天；角落测试：每次 20 次；mNSS 评分范围：0-14 阅读提示：Methods - Neurological functional assessment |