单细胞和批量转录组数据整合及差异基因筛选
鉴定与PCD和代谢相关的共表达基因，并评估其预后价值。
整合四个scRNA-seq数据集和三个bulk RNA-seq数据集，进行质量控制、聚类、细胞注释，鉴定细胞标志物和DEGs，并通过Pearson和Spearman相关分析确定共表达基因。
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机器学习驱动的多组学分析确定了与肝细胞癌程序性细胞死亡和代谢相关的预后基因特征。
Machine learning-driven multi-omics analysis identifies a prognostic gene signature associated with programmed cell death and metabolism in hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高整合多组学数据构建预后模型，并通过细胞系、动物模型及体外功能实验验证CCT3的作用。
主要模型
HCC细胞系（THLE-2, PLC5, MHCC97H, HLF, Huh-7, SNU449） 基因工程小鼠模型（Akt/hMet等8种） HCC患者样本（单细胞和批量转录组数据）
重点核对
细胞系类型及培养条件：THLE-2使用专用培养基，其他细胞系使用DMEM或RPMI-1640加10%FBS和1%青霉素-链霉素，37°C、5%CO2。 CCT3敲低方法：SNU449细胞使用CALNP™ RNAi试剂（D-Nano Therapeutics, DN005）转染siRNA，序列为GCCAGAACACAAAGCGUGAAUTT。 细胞增殖检测：CCK-8试剂盒，每孔5×10^3细胞，孵育40分钟，测450nm吸光度。 动物模型建立：通过流体力学尾静脉注射质粒组合构建8种HCC模型，每组5个生物学重复。
摘要
背景：肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，由于治疗选择有限，对全球死亡率有显著影响。程序性细胞死亡（PCD）和代谢是关键的癌症标志，影响肿瘤进展和治疗反应。然而，它们在HCC中的关联仍未得到充分表征。方法：我们利用单细胞和批量转录组数据集来鉴定与HCC中PCD和代谢强烈相关的差异表达基因（DEGs）。基于预后相关的DEGs，使用相应的计算算法将患者和细胞分为高表达和低表达组。两个数据集的交集DEGs使用单变量Cox回归进行分析，并通过机器学习算法构建了预后风险评分模型。该模型随后在免疫微环境及其与免疫治疗反应的相关性背景下进行评估。通过整合机器学习、深度学习和分子对接策略进行药物重定位，以发现潜在的治疗选择。同时，进行共识聚类分析以评估模型相关基因的分组效率。最后，在HCC小鼠模型和细胞系中评估了模型基因的表达，并通过体外实验进一步研究了代表性基因的生物学功能。结果：我们开发了一个基于PCD和代谢的18基因特征，对HCC患者的总生存期（OS）具有很强的预测价值。具有高PCD-代谢评分的恶性细胞可能通过影响免疫浸润、成纤维细胞分化和癌症相关通路来促进HCC进展。该模型还与免疫治疗敏感性相关。利用由PCD-代谢模型指导的药物重定位策略，我们确定了三唑并噻二嗪和氟伐他汀分别作为靶向RCN2和CDK4的有前景的化合物。聚类分析确定了两种HCC亚型（C1和C2），富含高风险患者的亚型与较差的OS相关。值得注意的是，模型中的关键基因CCT3在肿瘤区域富集，其沉默被发现抑制HCC细胞的增殖和迁移，同时调节铁死亡和自噬相关标志物。结论：我们的研究建立了基于PCD-代谢的HCC预后模型，为疾病生物学和个性化治疗的潜在途径提供了见解。补充信息：在线版本包含补充材料，可访问10.1186/s12575-025-00286-1。关键词：肝细胞癌，程序性细胞死亡，代谢，预后，治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 程序性细胞死亡与代谢之间的相互作用如何在肝细胞癌中影响肿瘤进展、预后及治疗反应？
- 核心机制
- PCD与代谢的交叉对话通过调节免疫浸润、成纤维细胞分化（特别是LpmCAF）和癌症相关通路促进HCC进展。
- 主要证据
- 基于单细胞和批量转录组数据构建的18基因预后模型，在多个独立队列中验证其预测价值；CCT3敲低抑制细胞增殖和迁移，并调节铁死亡和自噬相关标志物。
- 研究意义
- 为HCC提供预后分层工具和个性化治疗策略的潜在靶点，特别是在免疫治疗和药物重定位方面。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基于共表达基因的患者和细胞分型
将患者和细胞分为高、低PCD-代谢活性组。
使用ssGSEA对TCGA-LIHC患者评分，使用AddModuleScore对scRNA-Meta细胞评分，按中位数分为激活和非激活组。
机器学习构建预后风险评分模型
筛选关键调控基因并构建最优预后模型。
对共表达基因进行单变量Cox回归，结合10种机器学习算法（117种组合），基于C-index在训练和验证队列中选择最优模型。
模型的功能富集分析
探索高低风险组之间的分子差异。
使用WGCNA识别与高低风险相关的基因模块，并进行KEGG和GO富集分析。
单细胞水平的恶性细胞分析
评估PCD-代谢活性与肿瘤侵袭性特征的关联。
使用AUCell计算单细胞PCD-代谢评分，分析高低评分组的基因组不稳定性、增殖、细胞周期和通路富集。
细胞间通讯和免疫微环境分析
评估PCD-代谢活性与TME免疫细胞和成纤维细胞通讯的关联。
使用CellChat重建细胞通讯网络，比较高低风险组间的通讯强度、免疫浸润、免疫逃逸评分和成纤维细胞亚型。
免疫治疗反应预测
评估PCD-代谢评分对免疫治疗反应的预测价值。
分析六个免疫治疗bulk数据集和一个scRNA-seq数据集，比较高低评分组的生存和临床反应。
药物重定位和分子对接
识别对高风险组可能有效的候选药物。
使用pRRophetic分析CTRP和PRISM数据库药物敏感性，结合深度学习和分子对接预测药物-蛋白相互作用。
临床预后模型建立
构建结合风险评分和临床变量的列线图模型。
进行单变量和多变量Cox回归，构建列线图，评估校准曲线和DCA。
共识聚类以确定亚型
根据模型基因表达确定HCC分子亚型。
使用ConsensusClusterPlus对四个队列进行聚类，确定最佳k值，评估亚型间预后和免疫特征。
模型基因在细胞系和小鼠模型中的表达验证
验证模型基因在HCC中的表达差异。
通过DepMap数据库分析基因依赖性，在8种转基因小鼠模型和5种HCC细胞系中检测mRNA表达。
CCT3的功能实验验证
验证CCT3在HCC进展中的作用。
通过siRNA敲低CCT3，评估细胞活力、克隆形成、迁移以及铁死亡和自噬标志物的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据整合与预处理
转录组差异表达分析
共表达与相关分析
细胞通讯分析
基因共表达网络分析
药物敏感性预测
分子对接
深度学习预测
细胞功能实验
mRNA表达分析
组织学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | CALNP RNAi试剂 | D-Nano Therapeutics | DN005 |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Solarbio Life Sciences | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion | -- |
| 反转录 | Taq Pro通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green Pro Taq HS预混液 | Accurate Biotechnology | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| CCT3抗体 | Abclonal | -- | |
| Cyclin B1抗体 | Abclonal | -- | |
| PCNA抗体 | Affinity | -- | |
| LC3抗体 | Affinity | -- | |
| FTH1抗体 | Abcam | -- | |
| GPX4抗体 | Abcam | -- | |
| RNA测序 | NovaSeq X Plus测序平台 | Illumina | -- |
| TRIzol法 | -- | -- | |
| VAHTS Universal V6 RNA-seq文库制备试剂盒 | -- | -- | |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher | -- | |
| Labchip GX touch | PerkinElmer | -- | |
| Qubit 3.0荧光计 | Thermo Fisher | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| Bio-Rad CFX96实时PCR系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养基成分：THLE-2使用专用培养基，其他细胞系使用DMEM或RPMI-1640加10%FBS和1%青霉素-链霉素；培养条件37°C、5%CO2。 阅读提示：详见 Materials and Methods 中的 Cell Lines and Cell Culture 部分 |
| CCT3敲低 | 转染试剂（CALNP™ RNAi reagent, DN005）、siRNA序列（GCCAGAACACAAAGCGUGAAUTT）、转染时间和细胞系（SNU449）。 阅读提示：详见 Materials and Methods 中的 Cell Lines and Cell Culture 部分 |
| 细胞增殖检测 | 细胞密度（5×10^3细胞/孔）、CCK-8试剂体积（10μL）、孵育时间（40分钟）、检测波长（450nm）。 阅读提示：详见 Materials and Methods 中的 Cell Functional Experiments 部分 |
| 克隆形成实验 | siRNA转染48小时后接种于6孔板，培养时间（两周），固定和染色方法（多聚甲醛、结晶紫）。 阅读提示：详见 Materials and Methods 中的 Cell Functional Experiments 部分 |
| 迁移实验 | 划痕制作时间（转染后48小时），观察时间（0和24小时），使用无血清培养基。 阅读提示：详见 Materials and Methods 中的 Cell Functional Experiments 部分 |
| 动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6雄性、FVB/N雌性）、年龄（5周）、体重（18-20g）、饲养条件（SPF, 25±2°C, 湿度50±10%, 12小时光暗循环）、HCC模型构建方法（流体力学尾静脉注射）、每组重复数（5个生物学重复）。 阅读提示：详见 Materials and Methods 中的 Animal Model 部分 |
| Western blot | 细胞裂解液（RIPA缓冲液）、蛋白酶和磷酸酶抑制剂、BCA定量、上样缓冲液（5×）、变性温度和时间（105°C 10分钟）、SDS-PAGE、PVDF膜、封闭（5%脱脂牛奶）、一抗孵育条件（4°C过夜）、二抗孵育（25°C 1小时）、抗体种类和品牌（CCT3, Cyclin B1, PCNA, LC3, FTH1, GPX4）。 阅读提示：详见 Materials and Methods 中的 mRNA and Protein Analysis 部分 |
| RNA-seq | RNA提取方法（TRIzol）、建库试剂盒（VAHTS Universal V6）、测序平台（Illumina NovaSeq X Plus）、比对参考基因组（hg19）、定量方法（FPKM转TPM）、差异分析（Kruskal-Wallis检验）。 阅读提示：详见 Materials and Methods 中的 RNA-seq Analysis 部分 |
| 免疫治疗反应评估 | 数据集（GSE91061, Branu_2020, PRJEB23709, PHS000452, Nathanson_2017, GSE100797）、分组方法（中位数）、主要终点（总生存期和临床反应）。 阅读提示：详见 Results 中的 PCD-Metabolism Predicted Immune Therapy Response 部分 |
| 药物敏感性预测 | 数据库（CTRP v2.0和PRISM）、算法（pRRophetic）、相关分析（Spearman）、筛选标准（AUC显著降低且与风险评分负相关）。 阅读提示：详见 Materials and Methods 中的 Evaluation of Tumor Immunotherapy Response and Drug Sensitivity Prediction 部分 |