体内异种移植瘤模型建立与药物疗效评估
比较仑伐替尼和安罗替尼在体内的抗肿瘤效果
雌性BALB/c裸鼠皮下注射表达荧光素酶的8505 C细胞，待肿瘤达约60 mm³后随机分组，每日腹腔注射药物或对照，定期监测肿瘤体积和体重，并通过生物发光成像评估肿瘤生长。
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内质网应激-铁死亡交互信号协调安罗替尼在甲状腺未分化癌中的抗肿瘤作用
The endoplasmic reticulum stress-ferroptosis reciprocal signaling orchestrates anti-tumor effect of anlotinib in anaplastic thyroid cancer.
实验完整度
高包含体内异种移植瘤模型、体外细胞功能实验、分子机制验证（Western blot、流式）及免疫组化分析等多个独立证据层级。
主要模型
Luciferase-8505 C细胞皮下异种移植瘤模型（BALB/c裸鼠） 人甲状腺未分化癌细胞系8505 C和KHM-5 M
重点核对
药物处理浓度：安罗替尼和仑伐替尼在体外实验中的浓度范围 体内给药剂量：2 mg/kg和4 mg/kg，腹腔注射，每日一次 动物模型：雌性BALB/c裸鼠，皮下注射Luciferase-8505 C细胞5×10^6个 检测时间点：体外处理24、48、72小时，体内观察15天 铁死亡和ER应激标志物：GPX4、HO-1、ATF4、BiP、CHOP等的蛋白表达
摘要
背景：铁死亡诱导治疗是治疗甲状腺未分化癌（ATC）的一种有前景的方法，这是一种高度致命的癌症。然而，两种抗血管生成药物仑伐替尼和安罗替尼对ATC中铁死亡的具体影响尚不清楚。方法：为研究仑伐替尼和安罗替尼在体内的抗癌活性，在小鼠中建立了皮下肿瘤模型。使用包括CCK-8、集落形成、Transwell和球体形成等多种实验评估了这些药物对ATC细胞的药理作用。通过管形成实验评估血管生成。通过流式细胞术测量活性氧（ROS）水平，并通过Western blot实验测定铁死亡和内质网（ER）应激的水平。使用免疫组织化学分析肿瘤组织中GPX4、HO-1、PERK和CHOP的表达。结果：仑伐替尼和安罗替尼均剂量和时间依赖性地抑制Luciferase-8505 C诱导的小鼠皮下肿瘤，其中安罗替尼显示出比仑伐替尼更好的疗效。体外实验表明，虽然两种药物均能有效抑制血管生成，但安罗替尼在细胞活力、增殖、肿瘤球形成、迁移和侵袭方面表现出更优的抗肿瘤效果。机制研究表明，安罗替尼通过ER应激途径诱导ROS介导的铁死亡，而仑伐替尼处理未观察到这种反应。结论：安罗替尼在治疗ATC方面显示出优于仑伐替尼的疗效，且与其抗血管生成特性无关。安罗替尼诱导ER应激介导的铁死亡的能力表明，靶向铁死亡可能作为ATC的一种有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 仑伐替尼和安罗替尼在甲状腺未分化癌中的抗肿瘤机制差异，特别是它们诱导铁死亡的能力。
- 核心机制
- 安罗替尼通过激活内质网应激通路（上调ATF4、BiP、CHOP和p-eIF2α）诱导ROS介导的铁死亡，而仑伐替尼未诱导该通路。
- 主要证据
- 体内异种移植瘤模型显示安罗替尼抑制肿瘤生长更显著；体外实验显示安罗替尼诱导ROS和脂质ROS升高，下调GPX4、FTH1等铁死亡相关蛋白，上调HO-1；Western blot显示ER应激标志物上调。
- 研究意义
- 该研究提示靶向铁死亡可能成为甲状腺未分化癌的一种治疗策略，为优化临床治疗方案提供实验依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞活力与增殖评估
评估药物对ATC细胞活力的抑制作用及差异性
使用CCK-8实验检测不同浓度药物处理不同时间后的细胞活力，计算IC50值。
细胞功能实验（集落形成、迁移、侵袭、球体形成）
评估药物对ATC细胞增殖、迁移、侵袭和干性的影响
分别进行集落形成实验、Transwell迁移和侵袭实验、球体形成实验，比较两种药物的抑制作用。
血管生成评估
评估两种药物对血管内皮细胞管形成的影响
使用HUVECs进行管形成实验，在基质胶上观察药物处理后的管状结构形成情况。
铁死亡检测
检测药物处理对ROS、脂质ROS水平及铁死亡相关蛋白表达的影响
使用DCFH-DA探针和C11 BODIPY 581/591探针通过流式细胞术检测ROS和脂质ROS；通过Western blot检测铁死亡相关蛋白表达。
内质网应激通路验证
验证安罗替尼是否通过内质网应激通路诱导铁死亡
通过Western blot检测ER应激相关蛋白（PERK、ATF4、BiP、CHOP、p-eIF2α）的表达；使用ER应激激活剂TUDC进行联合处理，观察对铁死亡标志物的影响。
肿瘤组织免疫组化分析
验证体内肿瘤组织中铁死亡和ER应激标志物的表达变化
对异种移植瘤组织进行免疫组化染色，检测Ki67、GPX4、HO-1、BiP、CHOP和4-HNE的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 仑伐替尼 | Selleck | E7080 |
| 吐温80 | TargetMol | T13947 | |
| TUDC | TargetMol | T6993 | |
| PEG300 | TargetMol | T7022 | |
| Western blot | HRP标记的山羊抗兔IgG | Beyotime | A0208 |
| 山羊抗鼠IgG | Beyotime | A0216 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | SERANA | S-FBS-SA-015 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Vazyme Biotech | A311-01 |
| Synergy LX多功能酶标仪 | BioTek Instruments | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 侵袭实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 球体形成实验 | 超低吸附6孔板 | Corning | -- |
| DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| B27补充剂 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| ROS检测 | DCFH-DA探针 | TargetMol | T15458 |
| 脂质ROS检测 | C11 BODIPY 581/591探针 | Thermo Fisher | D3861 |
| 流式分析 | NovoCyte Advanteon流式细胞仪 | Agilent | -- |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ChemiDoc-MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 兔抗TFR抗体 | ABclonal | A19130 | |
| 兔抗FTH1抗体 | ABclonal | A19544 | |
| 兔抗FTL抗体 | ABclonal | A11241 | |
| HRP标记的β-微管蛋白小鼠单克隆抗体 | ABclonal | AC030 | |
| 兔抗HO-1抗体 | Proteintech | 10701-AP | |
| 兔抗ATF4抗体 | Proteintech | 10835-AP | |
| 兔抗GPX4抗体 | Abcam | ab125066 | |
| 兔抗PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 5683 | |
| 兔抗BiP抗体 | Cell Signaling Technology | 3177 | |
| 兔抗磷酸化eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 3597 | |
| 兔抗eIF2α抗体 | Affinity | AF6087 | |
| 小鼠抗4-HNE抗体 | Abcam | ab48506 | |
| 体内成像 | IVIS Lumina III活体成像系统 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内异种移植瘤模型 | 动物品系（雌性BALB/c裸鼠）、周龄（3-4周）、细胞系（Luciferase-8505 C）、细胞注射量（5×10^6/100 µL）、肿瘤起始体积（~60 mm³）、分组及每组动物数（5组，n=5）、给药剂量（2和4 mg/kg）、给药方式（腹腔注射，每日一次）、实验周期（15天）。 阅读提示：Materials and Methods 中的 In vivo xenograft tumor model 部分及 Figure 1 图注 |
| 体外细胞活力检测 | 细胞系（8505 C、KHM-5 M等）、细胞接种密度（4000/孔）、药物浓度梯度（安罗替尼0-32 µM；仑伐替尼0-64 µM）、处理时间（24, 48, 72 h）、CCK-8试剂盒及检测波长（450 nm）。 阅读提示：Materials and Methods 中的 Cell viability assay 部分及 Figure 2 图注 |
| 铁死亡检测（ROS及脂质ROS） | 处理浓度（安罗替尼和仑伐替尼0-16 µM）、处理时间（24 h）、探针浓度（DCFH-DA 10 µM；C11 BODIPY 581/591 20 µM）、孵育时间（30 min）、流式细胞仪型号（NovoCyte Advanteon）。 阅读提示：Materials and Methods 中的 Intracellular ROS and lipid peroxidation assays 部分及 Figure 5 图注 |
| Western blot蛋白质检测 | 细胞处理浓度（安罗替尼和仑伐替尼0-10 µM或0-12 µM）、处理时间（24 h）、抗体稀释比（例如GPX4 1:5000，HO-1 1:2000）、内参（β-Tubulin）、蛋白定量方法（BCA）、显影系统（ChemiDoc-MP）。 阅读提示：Materials and Methods 中的 Western blot analysis 部分及 Figures 5、6 图注 |
| 内质网应激验证 | TUDC浓度（20 µM）、处理时间（24 h）、药物浓度（安罗替尼5 µM）、分组设置（单独或联合）。 阅读提示：Materials and Methods 中的 Reagents and antibodies 部分和 Results 中的 Differential ER stress responses... 部分 |