Exosome-delivered METTL14 drives hypoxia-induced proliferation, metastasis, and glycolysis of breast cancer cells through regulating TRIM16-mediated FGF7 ubiquitination.
包含临床样本表达分析、体外细胞功能实验（敲低/过表达、MTT/EdU/Transwell/划痕）、机制验证（CoIP、MeRIP、RIP、双荧光素酶）以及体内异种移植模型，多个独立证据层级，且明确包含功能验证与机制验证。
TNBC细胞系（BT-549、MDA-MB-231） 缺氧处理细胞模型（1% O2） 小鼠异种移植瘤模型（MDA-MB-231） 临床组织样本（46对TNBC肿瘤及癌旁组织）
缺氧处理条件：1% O2、5% CO2、94% N2，处理48小时 FGF7敲低对缺氧诱导细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解的抑制效应 TRIM16与FGF7的相互作用及FGF7泛素化水平检测 METTL14介导的TRIM16 m6A修饰及其mRNA稳定性 体内外泌体注射剂量：每10万个受体细胞添加2 µg外泌体
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估FGF7在TNBC组织、细胞系及缺氧条件下的表达水平，并分析其与临床病理特征和预后的关系。
通过RT-qPCR和Western blot检测46对TNBC肿瘤及癌旁组织中FGF7表达，并检测TNBC细胞系（MDA-MB-468、BT-549、MDA-MB-231）和正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达；使用Kaplan-Meier分析生存率；将细胞置于缺氧条件下处理0、12、24、48小时检测FGF7表达。
验证FGF7下调是否抑制缺氧诱导的TNBC细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解。
使用si-FGF7转染BT-549和MDA-MB-231细胞，在缺氧或常氧条件下培养，通过MTT、EdU、Transwell、伤口愈合实验检测细胞活力、增殖、侵袭和迁移；通过试剂盒检测葡萄糖消耗、乳酸生成和ATP/ADP比值。
验证TRIM16是否通过泛素化途径降解FGF7。
利用STRING数据库预测TRIM16与FGF7相互作用；通过CoIP验证内源结合；通过过表达TRIM16观察FGF7蛋白和mRNA水平变化；通过CHX处理分析蛋白稳定性；通过泛素化实验检测FGF7泛素化水平。
验证TRIM16过表达是否抑制缺氧诱导的TNBC细胞功能，并检验FGF7过表达能否逆转该抑制作用。
在BT-549和MDA-MB-231细胞中转染OE-TRIM16或联合OE-FGF7，缺氧处理后通过MTT、EdU、Transwell、伤口愈合实验检测增殖、迁移、侵袭；通过相关试剂盒检测糖酵解指标。
验证METTL14是否通过m6A修饰调控TRIM16 mRNA的表达和稳定性。
使用RMbase、RMVar、SRAMP数据库预测TRIM16 mRNA m6A位点；敲低METTL14等m6A调节因子检测TRIM16蛋白变化；通过MeRIP-qPCR检测TRIM16 m6A水平；通过RIP验证METTL14与TRIM16 RNA结合；使用双荧光素酶报告基因实验检测m6A位点；通过放线菌素D处理检测mRNA稳定性。
验证YTHDF1作为m6A阅读蛋白是否结合TRIM16 mRNA并调控其稳定性。
通过ENCORI数据库预测YTHDF1与TRIM16相互作用；敲低YTHDF1后检测TRIM16 mRNA和蛋白水平；通过RIP检测YTHDF1与TRIM16 mRNA结合；通过放线菌素D处理检测mRNA稳定性。
验证抑制METTL14是否通过调控TRIM16影响缺氧诱导的TNBC细胞功能。
在BT-549和MDA-MB-231细胞中转染si-METTL14或联合si-TRIM16，缺氧处理后通过MTT、EdU、Transwell、伤口愈合实验检测细胞增殖、迁移、侵袭；通过相关试剂盒检测糖酵解指标；通过Western blot检测FGF7蛋白水平。
验证缺氧条件下TNBC细胞释放的外泌体能否将METTL14递送至受体细胞。
收集缺氧处理细胞的外泌体，通过TEM观察形态，通过Western blot检测外泌体标志物CD63、CD81和TSG101，通过RT-qPCR和Western blot检测METTL14水平；用荧光标记外泌体与受体细胞共孵育观察摄取；通过Western blot检测受体细胞中METTL14水平。
验证缺氧诱导的外泌体METTL14对TNBC肿瘤生长和转移的体内影响，并验证FGF7的参与。
将MDA-MB-231细胞或转染FGF7的细胞皮下注射到裸鼠，待肿瘤体积约100 mm³后，尾静脉注射从稳定敲低METTL14的细胞中分离的缺氧外泌体，监测肿瘤生长，第28天处死，检测肿瘤重量、Western blot、IHC、肺转移结节数。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Procell | CM-0290B, CM-0041, CM-0150B, CM-0525 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | Maxima H Minus cDNA合成预混液 | Invitrogen | -- |
| qPCR | PerfectStart Green qPCR SuperMix | TransGen Biotech | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Invitrogen | -- |
| 抗FGF7抗体 | Abcam | ab131162 | |
| 抗TRIM16抗体 | Abcam | ab72129 | |
| 抗METTL14抗体 | Abcam | ab309096 | |
| 抗METTL3抗体 | Abcam | ab240595 | |
| 抗YTHDF1抗体 | Abcam | ab220162 | |
| 抗WTAP抗体 | Abcam | ab155655 | |
| 抗FTO抗体 | Abcam | ab308105 | |
| 抗CD63抗体 | Abcam | ab271286 | |
| 抗CD81抗体 | Abcam | ab109201 | |
| 抗TSG101抗体 | Abcam | ab133586 | |
| 抗β-actin抗体 | Abcam | ab179467 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| MTT实验 | MTT试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| EdU实验 | EdU试剂 | RiboBio | -- |
| Transwell侵袭实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 糖酵解分析 | 葡萄糖消耗检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 乳酸检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ATP检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| CoIP实验 | 免疫沉淀裂解缓冲液 | Invitrogen | -- |
| 磁珠 | Millipore | -- | |
| MeRIP | DNase I | -- | -- |
| RIP实验 | RIP裂解缓冲液 | Millipore | -- |
| 双荧光素酶报告基因实验 | pGL3载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 外泌体标记 | Dil荧光染料 | Beyotime | -- |
| 活体成像 | 卡尺 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 缺氧处理 | 缺氧条件为1% O2、5% CO2和94% N2，处理时间为48小时 阅读提示：见"Materials and methods"下的"Clinical samples and cell culture" |
| 细胞功能实验 | MTT接种密度1×10^5，EdU接种密度5×10^3，Transwell接种密度1×10^5，糖酵解检测接种密度5×10^3 阅读提示：见"Materials and methods"下的"MTT assay"、"EdU assay"、"Matrigel invasion assay"、"Glycolysis metabolism analysis" |
| 蛋白泛素化检测 | CHX处理时间：0、5、10、20、25小时 阅读提示：见"Materials and methods"下的"Western blot assay"中的蛋白稳定性测定 |
| m6A修饰验证 | METTL14敲低使用si-METTL14，转染时间48小时 阅读提示：见"Materials and methods"下的"Cell transfection"和"MeRIP" |
| 外泌体实验 | 外泌体提取：收集缺氧处理48小时的细胞培养上清，外泌体浓度2 µg/100,000细胞 阅读提示：见"Materials and methods"下的"Isolation and characterization of exosomes"和"Transwell co-culture" |
| 体内实验 | 裸鼠周龄5-6周，细胞接种量2×10^6，分组每组5只，尾静脉注射外泌体，第28天处死 阅读提示：见"Materials and methods"下的"Tumor xenograft assay" |
