α-酮戊二酸对力克斯兔生产性能、毛囊发育和抗氧化能力的影响

Effects of the α-ketoglutaric acid on the performance, hair follicle development and antioxidant capacity of Rex rabbits.

作者信息Xiaosong Wang, Shu Li, Jiali Chen, Lei Liu, Fuchang Li
PMID41321535
期刊Anim Nutr
发布时间2025-08-12
DOI10.1016/j.aninu.2025.06.004

实验完整度

研究包含体外DPC细胞实验和动物饲养试验两个独立证据层级,并有转录组测序、Western blot、qPCR等机制验证。

主要模型

力克斯兔真皮乳头细胞系(DPCs) 力克斯兔(120日龄,饲喂AKG日粮)

重点核对

体外实验AKG处理浓度:6 mmol/L,处理时间:72 h 动物实验AKG添加水平:0、0.5%、1.0%和1.5% 动物实验每组兔数:40只(20公20母),饲养35天 Wnt通路抑制剂IWP-2处理验证细胞增殖机制 DPC细胞RNA测序(Illumina NovaSeq 6000,PE150)

摘要

本研究旨在探讨α-酮戊二酸(AKG) supplementation 对毛囊发育的影响,并评估其对力克斯兔生产性能和抗氧化能力的影响。该机制在体外模型中进行探索,并在动物试验中得到验证。首先,以AKG培养真皮乳头细胞(DPCs)系作为体外模型。接下来,将160只力克斯兔(120日龄,体重2473.20±17.08 g)分为4组,每组40只(20公20母),分别饲喂添加0、0.5%、1.0%和1.5% AKG的日粮35天。结果显示,6 mmol/L AKG显著促进细胞增殖(P<0.001),减少合成(S)期细胞比例并增加G2期细胞比例(P<0.01)。转录组学结果表明,AKG增强了DPCs的外泌体分泌能力,增加了对外部信号分子的敏感性,并改善了其对邻近细胞的调节作用。此外,研究结果表明,AKG介导的毛囊发育促进可能与Wnt信号通路有关。同时,AKG提高了DPCs和力克斯兔皮肤组织中Wnt信号通路基因和蛋白的表达水平(P<0.05)。AKG处理增加了DPCs中谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的浓度(P<0.05)。最后,1.5% AKG显著提高了力克斯兔的生产性能、屠宰性能、初级毛囊密度、次级毛囊密度和总毛囊密度,显著提高了皮肤、肝脏和血清中的抗氧化能力,同时上调了皮肤组织中抗凋亡和抗氧化相关基因的表达(P<0.05)。总之,日粮中添加1.5% AKG显著改善了力克斯兔的生产性能、毛囊密度和抗氧化能力。AKG可能通过减少细胞内氨基酸分解代谢和增强Wnt信号通路来促进毛囊发育。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
AKG能否通过影响毛囊发育来改善力克斯兔的生产性能,并调节抗氧化能力?
核心机制
AKG通过增强Wnt/β-catenin信号通路(上调Wnt10b、β-catenin,下调DKK1、p-GSK-3β)并减少细胞内氨基酸分解代谢来促进毛囊发育。
主要证据
体外实验显示6 mmol/L AKG促进DPCs增殖,通过IWP-2抑制Wnt通路验证了机制;动物实验显示1.5% AKG显著增加毛囊密度、抗氧化能力,并上调皮肤中Wnt相关基因和蛋白。
研究意义
本研究为AKG在兔业中作为饲料添加剂的应用提供了理论依据。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

体外DPCs培养与增殖检测

探究AKG对DPCs活力的影响并确定最佳浓度

使用不同浓度AKG(0, 3, 6, 9, 12, 15 mmol/L)处理DPCs 24、48和72小时,通过CCK-8检测细胞活力;后续采用6 mmol/L AKG处理72小时。

2

细胞周期分析

检测AKG对细胞周期分布的影响

用流式细胞仪和PI染色分析细胞周期。

3

转录组测序及差异表达分析

识别AKG处理引起的基因表达变化及富集通路

对CON和AKG组DPCs进行RNA-seq,用DESeq2分析差异表达基因,并进行GO和KEGG富集分析。

4

基因和蛋白表达验证

验证AKG对Wnt信号通路及毛囊发育相关基因和蛋白表达的影响

用RT-qPCR检测DPCs和皮肤组织中基因表达,用Western blot检测蛋白表达,并观察β-catenin核转位。

5

Wnt通路抑制剂验证

验证AKG诱导的细胞增殖是否依赖于Wnt通路

在AKG处理基础上加入Wnt通路特异性抑制剂IWP-2,检测细胞活力。

6

细胞内氨基酸含量测定

评估AKG对DPCs内氨基酸代谢的影响

使用LC-MS测定DPCs内靶向氨基酸含量。

7

动物饲养试验

评估日粮AKG对力克斯兔生产性能、屠宰性能和毛囊发育的影响

160只力克斯兔随机分为4组,饲喂添加0、0.5%、1.0%、1.5% AKG的日粮35天,测定生产性能、屠宰性能、毛囊密度。

8

抗氧化能力测定

评估AKG对血清、肝脏和皮肤抗氧化指标的影响

测定血清、肝脏和皮肤中MDA、SOD、CAT、T-AOC和T-GSH含量。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

细胞活力检测
细胞周期分析
基因表达检测
蛋白表达检测
氨基酸含量测定
组织学分析
抗氧化指标测定
统计分析与可视化

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Pricella Biotechnology Co., Ltd.--
胎牛血清Pricella Biotechnology Co., Ltd.--
CCK-8试剂盒NCM Biotech Co., Ltd.--
二甲基α-酮戊二酸GlpBio--
IWP-2Beyotime Biotechnology Co., Ltd.--
细胞周期试剂盒BD Biosciences550825
无EDTA胰蛋白酶NCM Biotech Co., Ltd.--
AccQ Tag衍生化试剂Waters Corp.--
Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高效液相色谱仪Waters--
Waters UPLC HSS T3色谱柱Waters--
Waters XEVO TQ-S Micro质谱仪Waters--
α-酮戊二酸Zhenghe Pharmaceutical Bioengineering Co., Ltd.--
病理切片扫描仪WS-10Wisleap Medical Technology Co., Ltd.--
丙二醛检测试剂盒Nanjing Jiancheng BioEngineering InstituteA003-1-2
总超氧化物歧化酶检测试剂盒Nanjing Jiancheng BioEngineering InstituteA001-3-2
总抗氧化能力检测试剂盒Nanjing Jiancheng BioEngineering InstituteA015-2-1
总谷胱甘肽检测试剂盒Nanjing Jiancheng BioEngineering InstituteA061-1-2
过氧化氢酶检测试剂盒Nanjing Jiancheng BioEngineering InstituteA007-1-1
BCA蛋白定量试剂盒Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.--
TRIzol试剂Accurate Biology (Hunan) Co., Ltd.--
NanoDrop 2000超微量分光光度计Thermo Fisher Scientific Inc.--
RTase III逆转录预混液Yugong Biotech Co., Ltd.--
SYBR Green Pro Taq HS预混qPCR试剂盒Accurate Biology (Hunan) Co., Ltd.--
QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统Thermo Fisher Scientific Inc.--
NanoDrop ND-1000超微量分光光度计Thermo Fisher Scientific Inc.--
Agilent 2100生物分析仪Agilent Technologies Inc.--
Illumina NovaSeq 6000测序平台Illumina--
RIPA裂解液----
10% SDS-PAGE凝胶NCM Biotech Co., Ltd.--
0.45 μm PVDF膜Monad Biotech Co., Ltd.--
FUSION FX成像系统Vilber Lourmat--
Wnt10b抗体Beyotime Biotechnology Co., Ltd.AG3574
BMP2抗体Beyotime Biotechnology Co., Ltd.AF0075
BMP4抗体Beyotime Biotechnology Co., Ltd.AF6312
EGF抗体Beyotime Biotechnology Co., Ltd.AF6768
HGF抗体Beyotime Biotechnology Co., Ltd.AF7086
Smad4抗体Beyotime Biotechnology Co., Ltd.AF1291
DKK1抗体Proteintech Co., Ltd.21112-1-AP
GAPDH抗体Proteintech Co., Ltd.60004-1-Ig
磷酸化β-catenin抗体ABclonal Biotechnology Co., Ltd.AP1315
磷酸化GSK-3β抗体ABclonal Biotechnology Co., Ltd.AP1088

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
体外细胞培养与处理
AKG处理浓度6 mmol/L,处理时间72小时;Wnt抑制剂IWP-2的使用浓度
阅读提示:材料与方法2.2节,结果3.1和3.7节
动物饲养试验
动物品种(力克斯兔)、初始体重(2473.20±17.08g)、分组(4组每组40只,20公20母)、日粮AKG添加水平(0%、0.5%、1.0%、1.5%)、饲养周期(35天)
阅读提示:材料与方法2.5节
毛囊密度统计
皮肤样本固定、切片、染色方法;毛囊计数区域和计算公式(D=N/A)
阅读提示:材料与方法2.8节,结果3.11节
抗氧化指标测定
血清、肝脏、皮肤组织样本处理;试剂盒种类(MDA、T-SOD、T-AOC、T-GSH、CAT)及编号
阅读提示:材料与方法2.9节
转录组测序
细胞分组(CON/6mmol/L AKG处理72h)、每组3个重复;RNA-seq平台(Illumina NovaSeq 6000);差异基因阈值(FDR<0.05,|FC|>1.5)
阅读提示:材料与方法2.10节,结果3.3节