体外DPCs培养与增殖检测
探究AKG对DPCs活力的影响并确定最佳浓度
使用不同浓度AKG(0, 3, 6, 9, 12, 15 mmol/L)处理DPCs 24、48和72小时,通过CCK-8检测细胞活力;后续采用6 mmol/L AKG处理72小时。
Effects of the α-ketoglutaric acid on the performance, hair follicle development and antioxidant capacity of Rex rabbits.
研究包含体外DPC细胞实验和动物饲养试验两个独立证据层级,并有转录组测序、Western blot、qPCR等机制验证。
力克斯兔真皮乳头细胞系(DPCs) 力克斯兔(120日龄,饲喂AKG日粮)
体外实验AKG处理浓度:6 mmol/L,处理时间:72 h 动物实验AKG添加水平:0、0.5%、1.0%和1.5% 动物实验每组兔数:40只(20公20母),饲养35天 Wnt通路抑制剂IWP-2处理验证细胞增殖机制 DPC细胞RNA测序(Illumina NovaSeq 6000,PE150)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
探究AKG对DPCs活力的影响并确定最佳浓度
使用不同浓度AKG(0, 3, 6, 9, 12, 15 mmol/L)处理DPCs 24、48和72小时,通过CCK-8检测细胞活力;后续采用6 mmol/L AKG处理72小时。
检测AKG对细胞周期分布的影响
用流式细胞仪和PI染色分析细胞周期。
识别AKG处理引起的基因表达变化及富集通路
对CON和AKG组DPCs进行RNA-seq,用DESeq2分析差异表达基因,并进行GO和KEGG富集分析。
验证AKG对Wnt信号通路及毛囊发育相关基因和蛋白表达的影响
用RT-qPCR检测DPCs和皮肤组织中基因表达,用Western blot检测蛋白表达,并观察β-catenin核转位。
验证AKG诱导的细胞增殖是否依赖于Wnt通路
在AKG处理基础上加入Wnt通路特异性抑制剂IWP-2,检测细胞活力。
评估AKG对DPCs内氨基酸代谢的影响
使用LC-MS测定DPCs内靶向氨基酸含量。
评估日粮AKG对力克斯兔生产性能、屠宰性能和毛囊发育的影响
160只力克斯兔随机分为4组,饲喂添加0、0.5%、1.0%、1.5% AKG的日粮35天,测定生产性能、屠宰性能、毛囊密度。
评估AKG对血清、肝脏和皮肤抗氧化指标的影响
测定血清、肝脏和皮肤中MDA、SOD、CAT、T-AOC和T-GSH含量。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Pricella Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 胎牛血清 | Pricella Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | NCM Biotech Co., Ltd. | -- |
| 细胞处理 | 二甲基α-酮戊二酸 | GlpBio | -- |
| IWP-2 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 细胞周期分析 | 细胞周期试剂盒 | BD Biosciences | 550825 |
| 无EDTA胰蛋白酶 | NCM Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 氨基酸测定 | AccQ Tag衍生化试剂 | Waters Corp. | -- |
| Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高效液相色谱仪 | Waters | -- | |
| Waters UPLC HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| Waters XEVO TQ-S Micro质谱仪 | Waters | -- | |
| 动物日粮添加 | α-酮戊二酸 | Zhenghe Pharmaceutical Bioengineering Co., Ltd. | -- |
| 组织切片扫描 | 病理切片扫描仪WS-10 | Wisleap Medical Technology Co., Ltd. | -- |
| 抗氧化指标测定 | 丙二醛检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng BioEngineering Institute | A003-1-2 |
| 总超氧化物歧化酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng BioEngineering Institute | A001-3-2 | |
| 总抗氧化能力检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng BioEngineering Institute | A015-2-1 | |
| 总谷胱甘肽检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng BioEngineering Institute | A061-1-2 | |
| 过氧化氢酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng BioEngineering Institute | A007-1-1 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Accurate Biology (Hunan) Co., Ltd. | -- |
| RNA质量检测 | NanoDrop 2000超微量分光光度计 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| 逆转录 | RTase III逆转录预混液 | Yugong Biotech Co., Ltd. | -- |
| qPCR | SYBR Green Pro Taq HS预混qPCR试剂盒 | Accurate Biology (Hunan) Co., Ltd. | -- |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- | |
| RNA-seq | NanoDrop ND-1000超微量分光光度计 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies Inc. | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 10% SDS-PAGE凝胶 | NCM Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 0.45 μm PVDF膜 | Monad Biotech Co., Ltd. | -- | |
| FUSION FX成像系统 | Vilber Lourmat | -- | |
| Wnt10b抗体 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | AG3574 | |
| BMP2抗体 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | AF0075 | |
| BMP4抗体 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | AF6312 | |
| EGF抗体 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | AF6768 | |
| HGF抗体 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | AF7086 | |
| Smad4抗体 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | AF1291 | |
| DKK1抗体 | Proteintech Co., Ltd. | 21112-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech Co., Ltd. | 60004-1-Ig | |
| 磷酸化β-catenin抗体 | ABclonal Biotechnology Co., Ltd. | AP1315 | |
| 磷酸化GSK-3β抗体 | ABclonal Biotechnology Co., Ltd. | AP1088 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞培养与处理 | AKG处理浓度6 mmol/L,处理时间72小时;Wnt抑制剂IWP-2的使用浓度 阅读提示:材料与方法2.2节,结果3.1和3.7节 |
| 动物饲养试验 | 动物品种(力克斯兔)、初始体重(2473.20±17.08g)、分组(4组每组40只,20公20母)、日粮AKG添加水平(0%、0.5%、1.0%、1.5%)、饲养周期(35天) 阅读提示:材料与方法2.5节 |
| 毛囊密度统计 | 皮肤样本固定、切片、染色方法;毛囊计数区域和计算公式(D=N/A) 阅读提示:材料与方法2.8节,结果3.11节 |
| 抗氧化指标测定 | 血清、肝脏、皮肤组织样本处理;试剂盒种类(MDA、T-SOD、T-AOC、T-GSH、CAT)及编号 阅读提示:材料与方法2.9节 |
| 转录组测序 | 细胞分组(CON/6mmol/L AKG处理72h)、每组3个重复;RNA-seq平台(Illumina NovaSeq 6000);差异基因阈值(FDR<0.05,|FC|>1.5) 阅读提示:材料与方法2.10节,结果3.3节 |