成分鉴定与筛选
鉴定SADS水提物中的活性成分及其血清代谢物，并筛选具有抗炎活性的化合物。
采用UPLC-Q-TOF-MS对SADS水提物和给药后血清进行非靶向代谢组学分析，根据匹配分数>50和质量误差<1筛选化合物。
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防风根水提物通过作用于TNF-α和RAGE信号通路减轻类风湿关节炎
Aqueous extract of Saposhnikovia divaricata root alleviates rheumatoid arthritis by acting on TNF-α and RAGE signaling pathways.
实验完整度
高包含体外细胞实验（RAW264.7和成纤维样滑膜细胞）、体内动物模型（IL-1RA缺陷小鼠）、UPLC-Q-TOF-MS成分分析、网络药理学及功能验证（迁移实验、Western blot），证据层级完整。
主要模型
IL-1RA缺陷小鼠（BALB/c背景，自发RA模型） RAW264.7巨噬细胞 人成纤维样滑膜细胞
重点核对
IL-1RA缺陷小鼠（BALB/c背景）在4周龄开始给药，低剂量63 mg/kg、高剂量126 mg/kg灌胃，MTX组腹腔注射2 mg/kg每3天一次，持续5周。 细胞实验使用LPS刺激RAW264.7和成纤维样滑膜细胞，SADS浓度范围10 ng/mL至200 μg/mL，用于检测TNF-α、IL-6、IL-10表达和巨噬细胞极化。 RAGE信号通路验证：使用d-Ribose（RAGE激动剂）处理成纤维样滑膜细胞，检测迁移能力和RAGE表达。 UPLC-Q-TOF-MS分析鉴定SADS水提物中19种活性成分和血清中17种抗炎代谢物。 网络药理学筛选标准：OB≥30%，DL≥0.18，结合STRING和Cytoscape分析核心靶点。
摘要
防风（Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schisch）在《神农本草经》中被列为上品中药，因其具有祛风散寒、除湿止痛等免疫保护作用，并具有治疗类风湿关节炎（RA）的潜力。超过130种含有防风的中药复方用于RA治疗。然而，防风的活性成分和血清代谢物仍未被充分研究，其在RA中的确切作用机制也未完全阐明。因此，本研究旨在通过UPLC-Q-TOF-MS探索防风的活性成分和血清代谢物，并研究其在RA中的治疗机制。在防风中总共鉴定出5536种化合物，最终筛选出19种活性成分。在给予防风后的血清代谢物中，鉴定出4945种化合物，其中17种具有抗炎活性。网络药理学分析表明，防风可能通过TNF和晚期糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路发挥治疗RA的作用。防风减轻了IL-1RA缺陷RA小鼠的RA症状。在细胞模型中，防风通过调节TNF-α和RAGE通路抑制了成纤维样滑膜细胞的异常增殖。此外，防风促进M2巨噬细胞极化，同时抑制M1巨噬细胞极化。防风通过调节TNF-α和RAGE信号通路减轻了RA小鼠模型中实验性关节炎的进展，支持其作为RA治疗药物的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 防风根水提物的活性成分和血清代谢物是什么，以及它们如何通过分子机制减轻类风湿关节炎？
- 核心机制
- SADS通过调节TNF-α和RAGE信号通路，抑制炎症因子表达、抑制成纤维样滑膜细胞增殖和迁移，并促进M2巨噬细胞极化、抑制M1极化。
- 主要证据
- 体外实验显示SADS抑制LPS诱导的TNF-α和IL-6上调，恢复IL-10表达，促进M2极化；迁移实验和Western blot证实SADS通过RAGE通路抑制细胞迁移。体内实验显示SADS改善IL-1RA缺陷小鼠的关节炎评分、骨侵蚀和组织病理。
- 研究意义
- 本研究阐明了SADS治疗RA的分子机制，为含SADS的中药复方治疗RA提供参考，并为其临床应用提供理论支持。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
网络药理学分析
预测SADS活性成分和血清代谢物的作用靶点及富集通路。
利用TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction、GeneCards等数据库获取化合物和疾病靶点，构建Venn图，STRING数据库构建PPI网络，并进行GO和KEGG富集分析。
体外抗炎活性验证
评估SADS对LPS诱导的RAW264.7和成纤维样滑膜细胞炎症反应的影响。
用LPS刺激细胞，检测TNF-α、IL-6、IL-10的mRNA表达（RT-PCR），TNF-α蛋白表达（Western blot），以及巨噬细胞极化（流式细胞术）。
迁移实验验证RAGE通路
验证SADS是否通过RAGE信号通路抑制成纤维样滑膜细胞的异常迁移。
使用划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移，并用d-Ribose（RAGE激动剂）处理以验证RAGE介导的机制。
体内疗效评估
评估SADS对IL-1RA缺陷小鼠自发RA模型的治疗效果。
将IL-1RA缺陷小鼠分为对照组、模型组、SADS低剂量组、SADS高剂量组和MTX组，给药5周后评估关节炎指数、足肿胀、Micro-CT骨参数、组织病理染色（H&E、Masson、番红固绿）和免疫组化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
成分鉴定与分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM高糖培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素B | -- | -- | |
| 药物处理 | D-核糖 | Medchemexpress | HY-W018772 |
| ELISA检测 | TNF-α ELISA试剂盒 | Boster | EK0527 |
| IL-10 ELISA试剂盒 | Boster | EK0417 | |
| RT-PCR | Hieff® qPCR SYBR Green预混液（Low Rox Plus） | Yeasen | -- |
| Vazyme RNA提取试剂盒 | Vazyme | -- | |
| Yeasen逆转录试剂盒 | Yeasen | -- | |
| 组织染色 | 番红固绿染色试剂盒 | Solarbio | G1371 |
| 免疫组化 | TNF-α一抗 | Boster | BA0131 |
| IL-10一抗 | Boster | A00021-3 | |
| IL-1β一抗 | Sanying | 16806-1-ap | |
| RAGE一抗 | Sanying | 66833-1-Ig | |
| 流式细胞术 | CD206一抗 | Boster | A02285-2 |
| CD86一抗 | Boster | BM4121 | |
| ELISA检测 | TNF-α ELISA试剂盒 | Meimian | MM-47831M2 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Meimian | MM-1011M2 | |
| 细胞培养 | RAW264.7细胞系 | Procell | CL-0190 |
| 人成纤维样滑膜细胞 | Procell | CP-H241 | |
| 动物实验 | IL-1受体拮抗剂缺陷小鼠 | GemPharmatech | T058785 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SADS提取物制备 | 提取条件：SADS与水比例1:10，65°C水浴24小时，过滤后旋蒸、冻干。 阅读提示：见Materials and Methods 2.4节 |
| 体外细胞实验 | 细胞系：RAW264.7（Procell CL-0190）和人成纤维样滑膜细胞（Procell CP-H241）；培养条件：DMEM高糖+10% FBS（FLS额外加1%三抗）；SADS处理浓度范围10 ng/mL至200 μg/mL；LPS刺激浓度未明说。 阅读提示：见Materials and Methods 2.2节和Results 3.3节 |
| 动物实验 | 小鼠品系：BALB/c背景IL-1RA缺陷小鼠（GemPharmatech T058785），雄性4周龄；分组：Ctrl（野生型？）、Model（IL-1RA−/−）、SADS-L（63 mg/kg灌胃）、SADS-H（126 mg/kg灌胃）、MTX（2 mg/kg腹腔注射每3天）；给药周期5周；关节炎评分每5天记录。 阅读提示：见Materials and Methods 2.12节和Results 3.4节 |
| RAGE信号验证 | d-Ribose（RAGE激动剂）浓度未明说；SADS剂量依赖效应；检测指标：RAGE mRNA和蛋白表达，迁移能力。 阅读提示：见Materials and Methods 2.3节和Results 3.9节 |
| 网络药理学分析 | 筛选标准：OB≥30%，DL≥0.18；PPI网络置信度0.4；核心靶点筛选标准：Degree、Closeness、Betweenness大于平均值。 阅读提示：见Materials and Methods 2.6-2.9节 |