ADMSCs培养与表征
验证ADMSCs的干性和分化潜能。
培养小鼠ADMSCs，进行成骨和成脂诱导分化，通过茜素红染色和油红O染色验证分化能力，流式细胞术检测表面标志物。
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脂肪间充质干细胞来源的细胞外囊泡携带microRNA-214-3p靶向GSTZ1抑制脓毒症期间肺上皮细胞铁死亡
Adipose-derived mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles carry microRNA-214-3p to target GSTZ1 to curb ferroptosis in lung epithelial cells during sepsis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（LPS诱导MLE-12细胞铁死亡模型）和体内动物实验（CLP小鼠模型），并进行功能验证（GSTZ1过表达）和机制验证（双荧光素酶报告基因）。
主要模型
MLE-12小鼠肺上皮细胞系 C57BL/6小鼠CLP诱导脓毒症ALI模型 小鼠ADMSC细胞系 ADMSC-EVs
重点核对
LPS浓度1 μg/mL处理24小时 ADMSC-EVs剂量1×10^8个处理24小时 Fer-1浓度2 μM处理24小时 CLP手术使用18号针头穿刺2次 EVs气管内注射剂量50 μg
摘要
铁死亡在脓毒症引起的肺部疾病中起作用。间充质干细胞来源的细胞外囊泡（MSC-EVs）在铁死亡中起作用。本研究探讨了脂肪间充质干细胞来源的细胞外囊泡（ADMSC-EVs）在脓毒症期间保护肺上皮细胞免受铁死亡影响的机制。通过超速离心提取ADMSC-EVs，随后对ADMSC和EV进行表征。MLE-12细胞接受24小时脂多糖（LPS）处理以模拟脓毒症诱导的铁死亡，并用EV、铁死亡抑制剂（Fer-1）或谷胱甘肽S-转移酶zeta 1过表达质粒处理。评估了细胞活力，以及谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、Fe2+、活性氧（ROS）、脂质过氧化（LPO）、铁死亡相关蛋白（谷胱甘肽过氧化物酶4 [GPX4]、溶质载体家族7成员11 [SLC7A11]）、miR-214-3p和GSTZ1的水平。通过盲肠结扎穿刺术建立脓毒症诱导的急性肺损伤小鼠模型，并通过气管内注射EV，随后评估每分钟静息通气量、吸气阻力、动态肺顺应性、肺湿干比和肺组织细胞形态。通过Starbase数据库和双荧光素酶实验分析miR-214-3p-GSTZ1靶向关系。LPS处理降低了MLE-12细胞的活力，降低了GSH、GPX4和SLC7A11的水平，并升高了Fe2+和MDA含量以及ROS和LPO水平，而ADMSC-EVs逆转了这些效应。miR-214-3p在体外模型中下调。ADMSC-EVs携带miR-214-3p靶向GSTZ1。GSTZ1过表达部分抵消了ADMSC-EV在脓毒症期间抑制的肺上皮细胞铁死亡。在体内，ADMSC-EVs通过miR-214-3p/GSTZ1抑制铁死亡，从而改善脓毒症诱导的小鼠肺损伤。携带miR-214-3p的ADMSC-EVs通过靶向GSTZ1减弱肺上皮细胞的铁死亡，从而改善脓毒症诱导的肺损伤。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨ADMSC-EVs是否通过携带miR-214-3p靶向GSTZ1抑制脓毒症期间肺上皮细胞铁死亡，从而改善脓毒症诱导的肺损伤。
- 核心机制
- ADMSC-EVs携带miR-214-3p靶向并抑制GSTZ1表达，从而抑制肺上皮细胞铁死亡。
- 主要证据
- 体外实验中，ADMSC-EVs逆转LPS诱导的铁死亡标志物变化（如GSH降低、MDA和Fe2+升高），而GSTZ1过表达部分抵消这些效应；体内实验中，ADMSC-EVs改善CLP小鼠肺功能并抑制铁死亡相关蛋白变化。
- 研究意义
- 为脓毒症治疗提供理论依据，ADMSC-EVs可作为潜在的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ADMSC-EVs提取与表征
确认成功提取ADMSC-EVs并验证其特性。
通过超速离心提取EVs，使用TEM观察形态，NTA分析粒径和浓度，Western blot检测标志物。
体外脓毒症模型建立及ADMSC-EVs处理
验证ADMSC-EVs对LPS诱导的肺上皮细胞铁死亡的影响。
使用LPS处理MLE-12细胞建立铁死亡模型，随后用ADMSC-EVs或Fer-1处理，检测细胞活力、铁死亡指标。
验证ADMSC-EVs中miR-214-3p的作用
验证ADMSC-EVs通过携带miR-214-3p发挥对铁死亡的抑制作用。
用RNase和SDS处理EVs，检测miR-214-3p水平；构建miR-214-3p敲低的ADMSC-EVs，处理LPS诱导的MLE-12细胞，检测相关指标。
验证miR-214-3p靶向GSTZ1
验证miR-214-3p与GSTZ1的靶向结合关系。
使用Starbase数据库预测结合位点，双荧光素酶报告基因实验验证。
验证GSTZ1过表达对ADMSC-EVs效果的影响
验证GSTZ1是ADMSC-EVs抑制铁死亡的关键下游靶点。
在MLE-12细胞中过表达GSTZ1，同时用LPS和ADMSC-EVs处理，检测铁死亡指标。
体内动物模型验证
验证ADMSC-EVs在体内对脓毒症诱导的肺损伤和铁死亡的抑制作用。
建立CLP小鼠模型，气管内注射ADMSC-EVs，评估肺功能、肺水肿、组织病理和铁死亡指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM-F12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| CM-0680培养基 | Procell | -- | |
| 成脂分化培养基 | Cyagen | -- | |
| 成骨分化培养基 | Cyagen | -- | |
| 倒置显微镜 | Leica | DMI6000B | |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | MoFlo | |
| APC-CD29抗体 | Biolegend | 102215 | |
| FITC-CD44抗体 | Biolegend | 203906 | |
| FITC-CD45抗体 | BD Biosciences | 202205 | |
| APC-CD90抗体 | BD Biosciences | 202526 | |
| EV提取 | Allegra V-15R离心机 | Beckman Coulter | -- |
| Optima Max-TL台式超速离心机 | Beckman Coulter | -- | |
| EV表征 | 磷钨酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 透射电子显微镜 | FEI | -- | |
| 纳米粒子追踪分析仪 | Malvern Instruments | NS300 | |
| TSG101抗体 | Abcam | ab125011 | |
| CD63抗体 | Abcam | ab134045 | |
| CD81抗体 | Abcam | ab109201 | |
| Calnexin抗体 | Abcam | ab22595 | |
| EV提取对照 | GW4869 | Umibio Science | -- |
| EV处理 | 核糖核酸酶 | Beyotime | -- |
| SDS裂解液 | Beyotime | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 |
| miR-214-3p抑制剂 | GenePharma | -- | |
| 抑制阴性对照 | GenePharma | -- | |
| 细胞处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| Fer-1（铁死亡抑制剂） | Selleck | -- | |
| 细胞转染 | GSTZ1过表达质粒 | GenePharma | -- |
| 过表达阴性对照 | GenePharma | -- | |
| EV摄取实验 | PKH26标记试剂盒 | Sigma-Aldrich | PKH26GL |
| DAPI染色液 | Beyotime | C1005 | |
| 细胞活性检测 | CCK-8溶液 | WEIAOBIO | WH1199 |
| Multiskan FC酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | 51119080 | |
| ROS检测 | DCFH-DA ROS检测试剂盒 | Beyotime | S0033S |
| LPO检测 | BODIPY 581/591 C11荧光探针 | Thermo Fisher Scientific | D3861 |
| 荧光成像 | 荧光显微镜 | Leica | DMI6000B |
| 肺功能检测 | FinePoint PFT肺功能检测系统 | BUXCO | -- |
| 组织学观察 | 光学显微镜 | Zeiss | Axioscope |
| 铁含量检测 | 铁检测试剂盒 | Abcam | ab83366 |
| GSH检测 | GSH ELISA试剂盒 | MSK | 69-80233 |
| MDA检测 | MDA检测试剂盒 | Abcam | ab233471 |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Abcam | ab186029 |
| 双荧光素酶实验 | pmiR-GLO荧光素酶载体 | Promega | -- |
| GSTZ1野生型质粒 | Energiex | -- | |
| GSTZ1突变型质粒 | Energiex | -- | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Green实时PCR预混液 | Takara | -- | |
| 引物序列 | Sangon Biotechnology | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Yeasen Company | 20201ES76 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH85R | |
| GPX4抗体 | Abcam | ab125066 | |
| SLC7A11抗体 | Abcam | ab307601 | |
| GSTZ1抗体 | Invitrogen | PA5-100259 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab6721 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab6789 | |
| 增强化学发光液 | EMD Millipore | -- | |
| Western blot分析 | Image Pro Plus 6.0软件 | Media Cybernetics | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.5软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系、培养基、LPS浓度、处理时间、ADMSC-EVs剂量 阅读提示：Materials and methods 中的 'Cell treatment and grouping' 和相关图注 |
| EV提取与表征 | 超速离心参数、EV markers 阅读提示：Materials and methods 中的 'Extraction and characterization of extracellular vesicles (EVs)' |
| 动物模型建立 | 小鼠品系、年龄、性别、CLP手术细节（针头型号、穿刺次数）、EV给药方式与剂量 阅读提示：Materials and methods 中的 'Animal grouping and treatment' 和 'Detection of mouse lung function' |
| 铁死亡指标检测 | 试剂盒品牌、货号、检测方法 阅读提示：Materials and methods 中的 'Determinations of Fe2+, glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA), and ROS contents' |
| 机制验证 | 双荧光素酶报告基因实验质粒、转染条件 阅读提示：Materials and methods 中的 'Dual-luciferase reporter gene assay' |