识别PTC淋巴结转移相关枢纽基因
利用GEO数据集和生物信息学方法筛选与PTC淋巴结转移相关的关键基因
合并7个THCA数据集进行一致性聚类和WGCNA,结合LASSO分析鉴定重叠基因,确定FAM27E3为枢纽基因
Integrin factor (FAM27E3), as a metastatic marker of papillary thyroid carcinoma, through the p53 signaling pathway promoting lymph node metastasis.
包含生信分析(WGCNA、LASSO、CIBERSORT)和体外细胞实验(CCK8、Transwell、Western blot),但缺乏体内动物模型验证。
甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1 甲状腺乳头状癌细胞系IHH4 正常甲状腺细胞系Nthy-ori-3-1 GEO数据集(GSE60542等)
FAM27E3在PTC细胞系中的高表达(ELISA、RT-PCR) siRNA敲低效率(约60%和40%)及对细胞增殖、迁移、侵袭的影响 p53磷酸化水平变化及Vector-p53过表达对表型的恢复作用 TP53共沉默对FAM27E3敲低表型抑制的逆转(恢复至约80%)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
利用GEO数据集和生物信息学方法筛选与PTC淋巴结转移相关的关键基因
合并7个THCA数据集进行一致性聚类和WGCNA,结合LASSO分析鉴定重叠基因,确定FAM27E3为枢纽基因
确认FAM27E3在PTC细胞系中是否高表达
通过ELISA和RT-PCR检测正常甲状腺细胞系Nthy-ori-3-1与PTC细胞系TPC-1和IHH4中FAM27E3的表达
确定FAM27E3是否影响PTC细胞的增殖、迁移和侵袭能力
使用siRNA敲低TPC-1细胞中FAM27E3表达,通过CCK8、集落形成、Transwell实验评估细胞功能
验证FAM27E3是否通过p53信号通路发挥作用
通过Western blot检测p53磷酸化水平,过表达p53观察对敲低效应的回复,并联合敲低TP53验证
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-164基础培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | HyClone | -- | |
| 两性霉素B | Sigma-Aldrich | -- | |
| ELISA检测 | FAM27E3 ELISA试剂盒 | Shanghai Jinin Industrial Co., Ltd. | JN132560X |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX | Thermofisher | -- |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Tiangen Biotech | -- |
| RT-qPCR | HiScript II Q RT SuperMix用于qPCR | Vazyme | -- |
| LightCycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| CCK-8实验 | 细胞计数试剂盒-8 | Beyotime | -- |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 基质胶 | BD | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Beyotime | -- | |
| 抗p53抗体 | Beyotime | -- | |
| 抗磷酸化p53抗体 | CST | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Beyotime | -- | |
| ECL化学发光试剂盒 | -- | -- | |
| 数据处理 | Perl语言 | -- | -- |
| 数据分析 | R语言软件4.2.0 | -- | -- |
| GSEA软件 | -- | 4.1.0 | |
| SPSS软件 | SPSS Science | 22.0 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源(Nthy-ori-3-1、TPC-1、IHH4),培养基(RPMI-164),血清浓度(10% FBS),抗生素浓度 阅读提示:Methods 2.9 Cell culture |
| FAM27E3敲低 | siRNA序列(si-FAM27E3#1和#2),转染试剂(Lipofectamine RNAiMAX),敲低效率(约60%和40%) 阅读提示:Methods 2.11 SiRNA transfection |
| 细胞功能实验 | CCK-8细胞数(3000/孔),集落形成接种密度(1×10^3/孔)及培养时间(14天),Transwell细胞数(1×10^5/孔)及侵袭实验基质胶处理 阅读提示:Methods 2.14 CCK-8 assay, 2.15 Colony formation assay, 2.16 Transwell |
| p53过表达 | Vector-p53浓度(conc.1和conc.2),转染试剂(Lipofectamine 2000),转染后时间(48小时) 阅读提示:Methods 2.12 Vector-p53 transfection |
| Western blot | 抗体稀释比例(E-cadherin 1:800, p53 1:1000, p-p53 1:500, GAPDH 1:2000) 阅读提示:Methods 2.17 Western blot analysis |