数据获取与差异基因筛选
鉴定顺铂耐药和CTC相关的差异表达基因（DEGs）
从TCGA和GEO数据库获取NSCLC表达数据和临床信息；使用limma和Wilcoxon检验筛选DEGs，取交集得到177个顺铂耐药CTC相关基因。
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基于顺铂耐药和循环肿瘤细胞相关基因分析揭示非小细胞肺癌的预后特征
Deciphering the prognostic signature of nonsmall cell lung cancer using cisplatin resistance and circulating tumor cell-related gene analysis.
实验完整度
高包含生物信息学分析（TCGA/GEO数据、LASSO回归、免疫浸润）、体外细胞实验（qRT-PCR、Western blot、CCK-8、Transwell、流式凋亡检测）及功能验证（FAM83A过表达/敲低），多层级验证。
主要模型
TCGA-LUAD/LUSC数据集（998肿瘤样本，训练集） GSE41271数据集（274例NSCLC样本，验证集） GSE108214数据集（顺铂处理NSCLC样本，15耐药/7敏感） GSE58355数据集（6个CTC和6个原发NSCLC样本） A549和A549/DDP细胞系
重点核对
A549/DDP细胞系的顺铂耐药性验证（CCK-8） FAM83A在A549/DDP细胞中的表达水平（qRT-PCR和Western blot） si-FAM83A敲低效率验证（qRT-PCR和Western blot） FAM83A过表达对A549细胞增殖、侵袭和凋亡的影响（CCK-8、Transwell、流式）
摘要
本研究旨在基于顺铂耐药和循环肿瘤细胞（CTC）相关基因构建非小细胞肺癌（NSCLC）的预后预测模型，并探讨关键基因的分子机制。在下载并预处理来自癌症基因组图谱（TCGA）和基因表达综合数据库（GEO）的数据后，使用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归分析构建了预后特征。根据风险评分（RS）将患者分为低风险（LR）和高风险（HR）组，并比较了生存、免疫浸润以及免疫治疗/化疗反应方面的差异。为了临床应用，建立了列线图，随后确定了分子亚型。使用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）在A549和A549/DDP细胞系中验证了关键基因的表达。最后，我们探讨了抑制FAM83A逆转顺铂耐药的分子机制。通过LASSO回归，构建了包含八个基因的预后特征；HR组患者的生存率显著低于LR组患者（均P < 0.05）。RS是NSCLC的独立危险因素，并能稳定预测预后（P < 0.05）。LR和HR患者的免疫浸润水平存在显著差异，该模型能有效预测药物或免疫治疗的反应（均P < 0.05）。随后，亚型聚类将患者分为两组，以帮助识别不同风险患者之间的异质性。最后，qRT-PCR证实这些基因在A549细胞中异常表达，并与顺铂耐药密切相关（均P < 0.05）。值得注意的是，FAM83A过表达促进A549细胞的增殖和侵袭，并抑制其凋亡（均P < 0.05）。FAM83A低表达逆转了肺癌细胞的顺铂耐药（P < 0.05）。本研究构建的八基因模型可以预测NSCLC患者的预后并指导个体化治疗。此外，靶向抑制FAM83A表达可逆转顺铂耐药，可能增强化疗联合免疫治疗的疗效，从而为临床实践提供新的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何基于顺铂耐药和循环肿瘤细胞相关基因构建NSCLC的预后预测模型，并探索关键基因的分子机制？
- 核心机制
- FAM83A过表达通过促进细胞增殖和侵袭、抑制凋亡，从而促进顺铂耐药；抑制FAM83A表达可逆转顺铂耐药，其机制可能与调控细胞增殖和凋亡相关。
- 主要证据
- 基于TCGA和GEO数据构建八基因预后模型，通过qRT-PCR验证基因表达；通过过表达和敲低实验证实FAM83A在A549和A549/DDP细胞中促进顺铂耐药。
- 研究意义
- 八基因模型可预测NSCLC预后并指导个体化治疗；靶向抑制FAM83A可能逆转顺铂耐药，增强化疗联合免疫治疗的疗效，为临床提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
功能富集分析
探索重叠基因的生物学功能和通路
使用clusterProfiler对重叠基因进行GO和KEGG富集分析。
预后模型构建与验证
识别预后相关基因并构建风险评分模型
进行单变量Cox回归筛选预后基因，LASSO-Cox分析降维，逐步Cox回归确定八个核心基因，计算RS，根据中位值分组，并用KM、ROC评估模型。
列线图构建
建立临床预测工具
基于RS和临床信息（年龄、性别、TNM分期、阶段）进行单因素和多因素Cox回归，筛选独立预后因素，并用rms包构建列线图。
免疫微环境分析
比较高低风险组的免疫浸润差异
使用CIBERSORT和ssGSEA评估免疫细胞浸润，ESTIMATE计算免疫/基质评分和肿瘤纯度，并用Wilcoxon检验比较差异。
药物敏感性与免疫治疗反应预测
评估模型对化疗和免疫治疗反应的预测能力
从GDSC数据库获取药物敏感性数据，pRRophetic计算IC50；使用TIDE评分和免疫检查点表达评估免疫治疗反应。
单细胞RNA测序分析
定位模型基因在不同细胞类型中的表达分布
对GSE148071数据集进行质量控制、聚类和注释，分析特征基因的表达。
一致性聚类识别亚型
基于模型基因表达识别NSCLC分子亚型
使用ConsensusClusterPlus基于八基因表达进行聚类，确定最佳K值，评估亚型间预后和RS差异。
qRT-PCR验证基因表达
在细胞系中验证模型基因的表达差异
使用qRT-PCR检测16HBE、A549和A549/DDP细胞中八基因的mRNA表达。
FAM83A过表达功能实验
验证FAM83A对A549细胞增殖、侵袭和凋亡的影响
用FAM83A过表达质粒转染A549细胞，通过qRT-PCR和Western blot验证过表达效率，CCK-8检测增殖，Transwell检测侵袭，流式检测凋亡。
FAM83A敲低逆转顺铂耐药实验
验证抑制FAM83A是否能逆转顺铂耐药
在A549/DDP细胞中用siRNA敲低FAM83A，验证敲低效率，并通过CCK-8检测细胞活力，评估耐药性变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| qRT-PCR | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| BeyoRT II cDNA合成试剂盒 | Beyotime | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beijing Solabo | PC0020 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| FAM83A抗体 | ABclonal | -- | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗 | Proteintech | -- | |
| 成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| CCK-8实验 | CCK-8溶液 | -- | -- |
| 细胞培养 | 顺铂 | -- | 15663-27-1 |
| 流式凋亡检测 | Annexin V-FTTC | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：16HBE、A549和A549/DDP；培养基：RPMI-1640含10% FBS和100 μg/mL青霉素-链霉素；培养条件：37°C、5% CO2 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| qRT-PCR | 使用NanoDrop 2000评估RNA质量；BeyoRT II试剂盒合成cDNA；CFX96系统定量；GAPDH作为内参；2^-ΔΔCT计算相对表达 阅读提示：Materials and methods, qRT-PCR assay |
| Western blot | 使用RIPA裂解液；BCA定量；10% SDS-PAGE；PVDF膜；一抗浓度：anti-FAM83A 1:1000，anti-GAPDH 1:5000；二抗浓度：1:500 阅读提示：Materials and methods, Western blot analysis |
| CCK-8增殖实验 | 细胞密度：2.5×10^3细胞/孔，接种于96孔板；培养时间：24、48、72小时；CCK-8孵育时间：2小时；检测波长450 nm 阅读提示：Materials and methods, CCK-8 method |
| Transwell侵袭实验 | 细胞密度：5×10^5细胞/mL；接种100 μL细胞悬液，加入200 μL无血清培养基；培养时间：24小时；结晶紫染色，随机选取6个视野 阅读提示：Materials and methods, Transwell analysis |
| 流式凋亡检测 | 细胞密度：1×10^4细胞/mL；Annexin V-FTTC 和 PI 各5 μL；孵育时间：15分钟，避光；每组三个独立样本，每个样本平行观察三次 阅读提示：Materials and methods, Flow cytometry detection of apoptosis |
| FAM83A过表达实验 | 转染oe-FAM83A质粒或空载体；验证过表达效率（qRT-PCR和Western blot）；检测增殖（CCK-8）、侵袭（Transwell）、凋亡（流式） 阅读提示：Results, FAM83A overexpression promoted...; Figure 11 |
| FAM83A敲低实验 | 在A549/DDP细胞中转染si-FAM83A或对照；验证敲低效率；顺铂处理浓度（10μM）；检测细胞活力（CCK-8） 阅读提示：Results, Low expression of FAM83A reverses...; Figure 12 |