建立耐顺铂细胞系并验证耐药性
建立SCC9-CisR细胞系并确认其对顺铂的耐药性及与HIF-1α的关联。
通过逐步增加顺铂浓度处理SCC9细胞建立SCC9-CisR。使用CCK-8检测IC50和细胞活力，流式细胞术检测凋亡，肿瘤球形成实验检测干性，RT-qPCR检测CD44和SOX2 mRNA，Western blot检测HIF-1α蛋白。
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大黄素甲醚通过HIF-1α/MCT4/Wnt通路逆转舌鳞状细胞癌顺铂耐药并损害癌症干性
Rhaponitin Reverses Cisplatin Resistance and Impairs Cancer Stemness Through HIF-1α/MCT4/Wnt Pathway in Tongue Squamous Cell Carcinoma.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK-8、流式凋亡、肿瘤球、RT-qPCR、Western blot、双荧光素酶报告基因）和体内异种移植模型，并进行HIF-1α敲低/过表达功能验证及机制研究。
主要模型
SCC9人舌鳞状细胞癌细胞系 SCC9-CisR耐顺铂细胞系 BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型
重点核对
SCC9-CisR细胞通过逐步增加顺铂浓度（10^-7 mol/L至10^-5 mol/L）建立 Rha处理浓度：10 μM（体外实验），20 mg/kg（体内实验） 顺铂处理浓度：4.14 μM（体外），4 mg/kg（体内） HIF-1α敲低使用siHIF-1α#2，过表达使用pCMV6-HIF-1α载体 体内实验分组：SCC9-CisR+ saline+DMSO、+Cis、+Rha、+Cis+Rha，每组6只
摘要
大黄素甲醚（Rha）具有抗肿瘤活性，并介导缺氧诱导因子（HIF）-1α的转录活性，该活性影响顺铂（Cis）耐药。然而，Rha是否通过介导HIF-1α活性减轻舌鳞状细胞癌（TSCC）中的顺铂耐药尚不清楚。用Cis、Rha或Cis加Rha处理耐顺铂的SCC9（SCC9-CisR）细胞，使用细胞计数试剂盒-8、流式细胞术和肿瘤球形成实验探讨Rha对Cis耐药的影响。通过定量PCR检测干性标志物CD44和SOX2以及HIF-1α mRNA水平。使用GSE115119数据库和插件iRegulon选择由HIF-1α介导的靶基因。通过蛋白质印迹检测HIF-1α、单羧酸转运蛋白4（MCT4）和Wnt/β-catenin通路蛋白水平。构建皮下异种移植模型以探讨Rha对抗Cis耐药的功效。Rha在体外和体内抑制SCC9-CisR细胞的生长和干性。SCC9-CisR细胞中HIF-1α蛋白水平显著升高，但Rha处理减弱了HIF-1α的转录活性而非HIF-1α mRNA水平。与单独使用Cis相比，Rha加Cis抑制了SCC9-CisR细胞的活力和干性，但对HIF-1α敲低的SCC9-CisR细胞无此作用。HIF-1α过表达后，Rha诱导的SCC9-CisR细胞干性抑制和凋亡被逆转。Rha通过调控HIF-1α/MCT4轴抑制Wnt/β-catenin信号。总之，Rha降低了TSCC中的细胞干性并增强了Cis敏感性，这可能是通过介导HIF-1α/MCT4轴抑制Wnt/β-catenin信号实现的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Rha是否通过介导HIF-1α相关通路减轻舌鳞状细胞癌的顺铂耐药。
- 核心机制
- Rha通过抑制HIF-1α的转录活性，下调MCT4表达，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而降低细胞干性并增强顺铂敏感性。
- 主要证据
- 体外实验显示Rha降低SCC9-CisR细胞活力、促进凋亡、抑制肿瘤球形成及干性标志物表达；体内异种移植模型显示Rha联合顺铂显著抑制肿瘤生长。HIF-1α敲低/过表达实验证实了HIF-1α依赖性。
- 研究意义
- 研究表明Rha可作为顺铂的辅助药物用于舌鳞状细胞癌的治疗，为克服顺铂耐药提供潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估Rha对HIF-1α表达和转录活性的影响
检测Rha是否影响HIF-1α mRNA和蛋白水平及其转录活性。
用不同浓度Rha处理SCC9-CisR细胞，RT-qPCR检测HIF-1α mRNA，Western blot检测蛋白，双荧光素酶报告基因检测HIF-1α转录活性。
检测Rha对细胞活力、凋亡和干性的影响
评估Rha单独或联合顺铂对SCC9-CisR细胞活力、凋亡和干性的影响。
CCK-8检测细胞活力，流式细胞术检测凋亡，肿瘤球形成实验和RT-qPCR检测干性标志物。同时进行HIF-1α过表达和敲低实验验证机制。
体内验证Rha对顺铂耐药的作用
在皮下异种移植模型中验证Rha联合顺铂对肿瘤生长和干性的影响。
将SCC9或SCC9-CisR细胞皮下注射到BALB/c裸鼠，分为不同处理组，每日给药30天，测量肿瘤体积和重量，Western blot检测凋亡相关蛋白，RT-qPCR检测干性标志物。
机制研究：HIF-1α/MCT4/Wnt通路
探究Rha是否通过HIF-1α/MCT4轴抑制Wnt/β-catenin信号通路。
利用GSE115119数据库和iRegulon筛选HIF-1α靶基因，Western blot检测MCT4表达，以及细胞质和细胞核中Wnt通路蛋白水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Procell | PM150312 |
| 胎牛血清 | Thermo | 10100 | |
| 氢化可的松 | Invivochem | 50-23-7 | |
| 青霉素-链霉素 | Procell | PB180120 | |
| 药物处理 | 顺铂 | Sigma | P4394 |
| 细胞转染 | RiboFECT CP转染试剂盒 | Ribobio | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Beyotime | C0037 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/碘化丙啶双染试剂盒 | Solarbio | CA1020 |
| 肿瘤球形成 | B27添加剂 | Thermo | 17504044 |
| 人表皮生长因子 | Yeasen | 92701ES60 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Yeasen | 91334ES50 | |
| RNA提取 | MolPure细胞/组织总RNA提取试剂盒 | Yeasen | 19221ES |
| cDNA合成 | Hifair AdvanceFast第一链cDNA合成试剂盒 | Yeasen | 11149ES |
| RT-qPCR | Hieff UNICON通用型蓝色qPCR SYBR Green预混液 | Yeasen | 11184ES |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime | P0010 |
| Western blot | QuickBlock封闭液 | Beyotime | P0228 |
| 增强化学发光检测系统 | Beyotime | P0018 | |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| 微孔板读数 | Infinite 200 PRO酶标仪 | TECAN | -- |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 显微镜 | 显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | SCC9细胞系来源（Procell, #CL-0571），培养基成分（DMEM/F12 + 10% FBS + 400 ng/mL氢化可的松 + 1%青霉素-链霉素），培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.1 |
| 耐药细胞系建立 | 顺铂浓度梯度（10^-7至10^-5 mol/L），处理时间（未明确说明逐步加药的时间间隔） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.1 |
| 药物处理 | 顺铂处理浓度（4.140 μM），Rha处理浓度（10 μM），处理时间（Rha预处理12小时，顺铂处理24小时） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.3 |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度（1×10^3 cells/well），处理时间（24小时），CCK-8孵育时间（2小时），检测波长（450 nm） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.4 |
| 凋亡检测 | 染色试剂盒（Annexin V-FITC/PI），处理时间（24小时），流式细胞仪型号（BD） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.5 |
| 肿瘤球形成 | 细胞接种密度（1×10^3），培养时间（14天），培养基成分（血清-free DMEM/F12 + B27 + EGF + bFGF各20 ng/mL），计数标准（>50 μm） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.6 |
| RT-qPCR | RNA纯度要求（A260/A280 1.8-2.0），cDNA合成量（1 μg RNA），使用仪器（ABI7500），相对定量方法（2^-ΔΔCq） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.7 |
| Western blot | 蛋白提取缓冲液（RIPA），BCA定量，抗体信息（见表S2），内参蛋白（未明确说明） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.8 |
| 双荧光素酶报告实验 | 质粒（pGL3-HRE, pRL-SV40），细胞接种密度（1×10^3），Rha浓度（0-60 μM），处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.9 |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠），性别（雄性），年龄（4-6周），体重（18-23 g），细胞注射量（5×10^5 cells），给药方式（灌胃），剂量（Cis 4 mg/kg, Rha 20 mg/kg），给药频率（每日），持续时间（30天），分组（4组，每组6只） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.10 |
| 生物信息学分析 | GEO数据集GSE115119，差异表达基因阈值（p<0.05, |fold change|≥1），iRegulon插件用于转录因子预测 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.11 |