T. pyogenes刺激BEECs的炎症反应评估
确定T. pyogenes是否能诱导BEECs的炎症反应
BEECs以MOI=100感染T. pyogenes，处理6、12、24小时，检测炎性细胞因子的mRNA和蛋白水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
化脓隐秘杆菌膜囊泡在牛子宫内膜上皮细胞中以时间和剂量依赖性方式激活NLRP3和MyD88/NF-κB通路
Time- and dose-dependent activation of the NLRP3 and MyD88/NF-κB pathways by Trueperella pyogenes membrane vesicles in bovine endometrial epithelial cells.
实验完整度
高包含体外细胞实验（BEECs）、多种剂量和时间处理、多方法验证（ELISA、qPCR、Western blot、流式、SEM），并明确验证NLRP3和MyD88/NF-κB通路激活及细胞死亡机制。
主要模型
牛子宫内膜上皮细胞（BEECs） 化脓隐秘杆菌感染模型（MOI=100） 化脓隐秘杆菌膜囊泡处理模型（1×10^6-1×10^8颗粒/mL）
重点核对
T. pyogenes感染剂量MOI=100 MV浓度梯度（1×10^8, 1×10^7, 1×10^6颗粒/mL） 处理时间点（6, 12, 24小时） 检测的炎性细胞因子（IL-1β, IL-6, IL-18, TNF-α） 通路蛋白（NLRP3, MyD88, p-P65, GSDMD）
摘要
化脓隐秘杆菌是一种机会性病原体，常与牛子宫内膜炎相关，但其诱导子宫炎症的机制尚未完全阐明。本研究探讨了化脓隐秘杆菌及其膜囊泡（MVs）对牛子宫内膜上皮细胞（BEECs）的影响，并探索了所涉及的炎症通路。用化脓隐秘杆菌（MOI=100）或不同浓度（1×10^8、1×10^7或1×10^6颗粒/mL）的MVs处理BEECs 6-24小时。通过ELISA、qRT-PCR和western blotting分析炎症细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18或TNF-α）以及NLRP3和MyD88/NF-κB信号通路的激活。通过流式细胞术和扫描电子显微镜评估细胞死亡机制。化脓隐秘杆菌在6小时和12小时显著上调炎症细胞因子mRNA表达，在12小时和24小时上调蛋白表达。与12小时细菌刺激相比，MVs在6小时诱导NLRP3炎症小体更早激活。高浓度MVs诱导坏死样膜破裂，而中等浓度促进凋亡和焦亡。化脓隐秘杆菌及其MVs均激活MyD88/NF-κB信号通路，P65磷酸化在12小时显著增加。细胞因子分泌呈时间和剂量依赖性趋势，与转录变化一致。总之，这些发现表明化脓隐秘杆菌MVs通过NLRP3和MyD88/NF-κB信号通路促进子宫内膜炎症，且细胞死亡形式由MV浓度决定。这些发现强调MVs是牛子宫内膜炎的关键毒力因子和潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 化脓隐秘杆菌及其膜囊泡是否以及如何通过NLRP3和MyD88/NF-κB通路诱导牛子宫内膜上皮细胞的炎症反应和细胞死亡？
- 核心机制
- 化脓隐秘杆菌和其膜囊泡通过激活TLR4/MyD88/NF-κB和NLRP3炎症小体通路，促进炎性细胞因子释放并诱导不同形式的细胞死亡；高浓度MV诱导坏死，中等浓度诱导凋亡和焦亡。
- 主要证据
- BEECs实验显示，T. pyogenes和MV上调IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的mRNA和蛋白水平，并增加NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD蛋白表达及p-P65水平；流式和SEM显示细胞死亡模式差异。
- 研究意义
- 研究揭示化脓隐秘杆菌膜囊泡作为关键毒力因子，为牛子宫内膜炎的治疗干预提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MV的提取与表征
表征T. pyogenes来源的膜囊泡的物理形态和尺寸
提取T. pyogenes的MVs，通过SEM观察形态，通过DLS测量粒径和分布。
MV刺激BEECs的炎症反应评估
评估不同浓度MV对BEECs炎性细胞因子表达的影响
BEECs分别用1×10^8、1×10^7、1×10^6颗粒/mL的MV处理6、12、24小时，检测细胞因子的表达。
MyD88/NF-κB通路激活分析
探究T. pyogenes和MV是否激活MyD88/NF-κB通路
检测TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA和蛋白表达，以及P65磷酸化水平。
NLRP3炎症小体激活分析
探究T. pyogenes和MV是否激活NLRP3炎症小体及其下游效应
检测NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD的mRNA和蛋白表达，以及GSDMD裂解。
细胞活力评估
评估T. pyogenes和MV对BEECs活力的影响
使用CCK-8试剂盒检测处理后的细胞活力。
细胞死亡方式分析
确定T. pyogenes和MV诱导的细胞死亡类型
通过流式细胞术（Annexin V/PI染色）和SEM观察细胞形态。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Procell | -- |
| 胎牛血清 | EXCELL BIO | -- | |
| MV提取 | 脑心浸液肉汤 | Qingdao Hepo Bio-Technology | -- |
| MV提取试剂盒 | RENGEN BIOSCIENCES | -- | |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | Jianglai | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Jianglai | -- | |
| IL-18 ELISA试剂盒 | Jianglai | -- | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Jianglai | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | TransGen Biotech | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| cDNA合成 | Evo M-MLV反转录预混试剂盒 | AG (Hunan) | -- |
| qRT-PCR | ChamQ SYBR qPCR预混试剂盒 | Vazyme | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | 文中未明确说明 | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗NLRP3抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗ASC抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗Caspase-1抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗GSDMD抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗MyD88抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗P65抗体 | Abcam | -- | |
| 抗p-P65抗体 | Abcam | -- | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | TransGen Biotech | -- |
| SEM | 乙醇 | -- | -- |
| MV表征 | NanoStar II系统 | Wyatt Technology | -- |
| SEM | JSM-IT700HR扫描电子显微镜 | JEOL | -- |
| qRT-PCR | CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- |
| RNA纯度检测 | NanoDrop分光光度计 | NanoDrop Technologies | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | 文中未明确说明 | -- |
| 蛋白检测 | 化学发光检测系统 | Fujifilm | -- |
| 数据统计 | ImageJ软件 | National Institutes of Health | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | BEECs分离方法，培养条件（DMEM/F12，10% FBS，37°C，5% CO2），细胞接种密度（5×10^5 cells/mL） 阅读提示：Material and methods, Culture of bovine endometrial epithelial cells |
| T. pyogenes感染 | T. pyogenes培养至OD600≈0.6，感染复数MOI=100，处理时间6-24小时 阅读提示：Material and methods, Culture of T. pyogenes and extraction of MVs; Culture of bovine endometrial epithelial cells |
| MV提取 | MV提取试剂盒品牌（RENGEN BIOSCIENCES），离心条件（5000×g, 20min; 1500×g, 2min; 2000×g, 2min），结合缓冲液和洗脱液使用 阅读提示：Material and methods, Culture of T. pyogenes and extraction of MVs |
| MV处理 | MV浓度（1×10^8, 1×10^7, 1×10^6 particles/mL），处理时间6-24小时 阅读提示：Material and methods, MV exposure experiments |
| ELISA检测 | ELISA试剂盒品牌（Jianglai），细胞上清处理（1000×g, 10min, 4°C），检测的细胞因子（IL-1β, IL-6, IL-18, TNF-α） 阅读提示：Material and methods, ELISA |
| qRT-PCR | RNA提取试剂（TRIzol），cDNA合成试剂盒（Evo M-MLV），qPCR试剂（ChamQ SYBR），内参基因（GAPDH），引物序列（Table 1） 阅读提示：Material and methods, RNA isolation and real-time PCR; Table 1 |
| Western blot | 抗体品牌和稀释度（NLRP3 1:1500, ASC 1:5000, Caspase-1 1:2000, GSDMD 1:1000, MyD88 1:5000, P65 1:2000, p-P65 1:1000, β-actin 1:5000），蛋白质上样量20 μg 阅读提示：Material and methods, Western blotting |
| 细胞死亡分析 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，染色步骤（5μL Annexin V/PI，室温避光15分钟），流式细胞仪 阅读提示：Material and methods, Flow cytometry analysis |
| SEM成像 | 固定：2.5%戊二醛，1%四氧化锇，乙醇梯度脱水，金溅射，设备JSM-IT700HR 阅读提示：Material and methods, Scanning electron microscopy of BEECs |