SP感染鉴定与样本分组
确定感染鸡和未感染鸡的样本，以进行后续测序分析。
通过RPA和PCR检测，从100日龄白洛克母鸡中筛选出感染（P组）和未感染（N组）的个体，每组6只，采集脾脏组织。
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禽鸡白痢全基因组甲基化与转录组联合分析及基因功能验证
Joint analysis of whole-genome methylation and transcriptome in avian pullorum disease and validation of gene function.
实验完整度
高包括全基因组亚硫酸盐测序与转录组测序的组学分析，以及体外细胞实验（HD11细胞）过表达/干扰MSX2后的功能验证（qPCR和ELISA）。
主要模型
鸡脾脏组织（感染与未感染鸡白痢沙门氏菌） 鸡髓单核细胞系HD11
重点核对
SP感染的阳性判定（RPA和PCR结果一致） WGBS和RNA-seq的样本量（每组6只） MSX2过表达/干扰的转染时间（24小时） 细胞免疫因子（IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-3, TNF-α）表达水平的检测
摘要
由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡白痢可对生长和产蛋性能产生负面影响，导致家禽养殖业的重大经济损失。本研究通过全基因组亚硫酸盐测序和RNA测序，对感染SP的鸡（P组）和未感染SP的鸡（N组）的脾脏组织进行了功能富集分析。通过实时定量PCR和酶联免疫吸附试验验证了关键基因MSX2的功能。结果表明，P组脾脏甲基化模式发生显著变化，主要表现为启动子、内含子和外显子区域的低甲基化。联合分析确定了六个基因（MSX2、C21orf62、PGLYRP2、KCNQ3、SEZ6L和SLC38A11）在差异甲基化区域和差异表达基因中发生显著改变。MSX2基因过表达显著增强了鸡巨噬细胞中免疫因子[干扰素(IFN)-α、IFN-β、白介素(IL)-2、IL-3和肿瘤坏死因子-α]的表达和分泌，提示MSX2可能在鸡的免疫调节中发挥作用。本研究揭示了鸡白痢沙门氏菌感染对鸡脾脏组织DNA甲基化和基因表达的影响，筛选出多个潜在的治疗靶点，为鸡白痢的防控提供了新的见解和方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鸡白痢沙门氏菌感染如何影响鸡脾脏的DNA甲基化和基因表达，并找出潜在的关键功能基因。
- 核心机制
- SP感染导致脾脏DNA甲基化显著低甲基化，可能通过低甲基化激活免疫相关基因；MSX2可能通过影响BMP2/NF-κB等信号通路来调节免疫因子的表达和分泌。
- 主要证据
- WGBS和RNA-seq联合分析发现六个差异基因，其中MSX2在HD11细胞中过表达显著增强IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-3和TNF-α的表达和分泌（qPCR和ELISA验证）。
- 研究意义
- 该研究为理解鸡白痢的发病机制提供了新的分子靶点，并为制定预防和控制策略提供了潜在的基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）及甲基化分析
分析SP感染引起的全基因组DNA甲基化差异。
提取DNA后，进行亚硫酸盐转化，文库构建，NovaSeq6000测序；使用Bismark比对，MethylKit鉴定DMR，并进行GO和KEGG富集分析。
转录组测序（RNA-seq）及差异表达分析
分析SP感染引起的基因表达变化。
提取RNA，构建文库，NovaSeq测序；使用HISAT2比对，DESeq2/edgeR鉴定DEGs，并进行GO和KEGG富集分析。
DMG与DEG联合分析
筛选与甲基化和表达改变相关的关键基因。
取DMR相关基因与DEGs的交集，获得六个关键基因（MSX2, C21orf62, PGLYRP2, KCNQ3, SEZ6L, SLC38A11），并分别进行GO和KEGG富集。
候选基因表达验证（qPCR）
验证转录组测序结果的可靠性。
提取脾脏RNA，逆转录，qPCR检测六个关键基因的表达水平。
MSX2功能验证（细胞实验）
验证MSX2基因对鸡巨噬细胞免疫功能的影响。
在HD11细胞中过表达或敲低MSX2，通过qPCR检测免疫因子（IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-3, TNF-α）mRNA水平，通过ELISA检测TNF-α、IL-2和IL-6的分泌水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本采集 | 粪便DNA提取试剂盒 | Kangwei Reagent | -- |
| PCR | 引物SEEP400405 | Beijing Tsingke Biotechnology Company | -- |
| 引物STN | Beijing Tsingke Biotechnology Company | -- | |
| 引物SEP | Beijing Tsingke Biotechnology Company | -- | |
| WGBS | EZ DNA甲基化金试剂盒 | Zymo Research | -- |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 生物分析仪2100 | Agilent | -- | |
| RNA 6000 Nano LabChip试剂盒 | Agilent | -- | |
| Dynabeads oligo (dT)磁珠 | Thermo Fisher | -- | |
| 镁RNA片段化模块 | NEB | -- | |
| SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | -- | |
| 大肠杆菌DNA聚合酶I | NEB | -- | |
| RNase H | NEB | -- | |
| dUTP溶液 | Thermo Fisher | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| 热不稳定UDG酶 | NEB | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco | -- | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 质粒构建 | HiPure通用RNA试剂盒 | Magen | -- |
| siRNA合成 | 小干扰RNA | Genecreate.cn | -- |
| RNA提取 | Magzol试剂 | Magen | -- |
| cDNA合成 | HiScript III 一步法反转录预混液 | Vazyme | -- |
| qPCR | SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- |
| CFX96实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| T100 PCR热循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SP感染鉴定与样本分组 | RPA和PCR结果的一致性，样本分组标准（阳性/阴性），样本量（每组6只）。 阅读提示：见Materials and methods中Sample collection和PD detection部分，图1。 |
| WGBS | 测序平台、测序深度、DMR分析参数（window大小、步长、FDR阈值），样本量。 阅读提示：见Materials and methods中WGBS部分，Table 1。 |
| RNA-seq | RNA质量指标（RIN>7），文库插入片段大小，测序平台，DEG筛选阈值（FDR<0.05，|log2FC|≥1）。 阅读提示：见Materials and methods中RNA sequencing部分。 |
| MSX2功能验证 | HD11细胞培养条件，转染条件（质粒/ siRNA、时间），qPCR和ELISA检测的免疫因子。 阅读提示：见Materials and methods中Cell culture, treatment, and transfection、RNA extraction, cDNA synthesis, and qPCR和ELISA部分，图7。 |