动物感染模型建立与验证
建立IBV感染雏鸡模型，并验证感染是否成功。
17日龄SPF雏鸡感染IBV GX-YL5株（0.2 mL 10^6 EID50），于0、3、7、11、14 DPI采血检测抗体和病毒载量。
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感染传染性支气管炎病毒的雏鸡代谢物中肉桂酸显著升高及其在体内外显著的抗病毒作用
Significant Increase of Cinnamic Acid in Metabolites of Chicks Infected with Infectious Bronchitis Virus and Its Remarkable Antiviral Effects In Vitro and In Vivo.
实验完整度
高该研究包含血清代谢组学分析、体外细胞实验、体内动物实验及分子对接/动力学模拟等多个独立证据层级，且明确包含功能验证与机制验证。
主要模型
鸡胚肾（CEK）细胞 SPF雏鸡（IBV感染模型）
重点核对
IBV GX-YL5株，感染途径：眼鼻接种0.2 mL 10^6 EID50或10^5 EID50病毒液 血清代谢组学：感染后7 DPI采集血清，UPLC-MS/MS分析 体外实验：CEK细胞以MOI=1感染IBV，CA浓度0、6.25、12.5、25 μg/mL处理24 h 体内实验：14日龄SPF雏鸡，CA剂量0、10、25、50 mg/kg/d饮水给药5天
摘要
禽传染性支气管炎病毒（IBV）感染给家禽业造成了重大的经济损失。不幸的是，目前该病尚无有效的治疗方法。了解致病机制对于该病的治疗至关重要。基于代谢组学分析研究IBV的致病机制有助于识别抗病毒药物。然而，关于IBV感染的代谢组学研究相对有限，尤其是在IBV感染后血清的代谢组学分析。本研究以17日龄SPF雏鸡感染IBV GX-YL5株，于感染后第7天（DPI）采集血清样本，采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）进行代谢组学分析。共鉴定出143种差异代谢物，涉及20条代谢通路，其中苯丙氨酸途径变化最为显著。IBV感染后，苯丙氨酸途径上游代谢物肉桂酸（CA）的水平显著升高。为了研究CA的抗病毒作用，用不同浓度的CA处理感染IBV的鸡胚肾（CEK）细胞和SPF雏鸡，以评估其对病毒复制的影响。结果表明，25 μg/mL的CA在体外能有效抑制IBV复制；同时，50 μg/mL和25 μg/mL的CA在体内能有效抑制IBV复制。分子对接和分子动力学模拟研究表明，CA与IBV核衣壳（N）蛋白的N结构域相互作用。总之，IBV感染后血清代谢物CA显著升高，并在体内外表现出显著的抗病毒作用，为开发抗IBV感染的抗病毒疗法提供了有前景的途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IBV感染后宿主血清代谢物发生何种变化，以及差异代谢物是否具有抗IBV作用？
- 核心机制
- CA通过靶向IBV核衣壳（N）蛋白的N端结构域（NTD）稳定结合，从而抑制IBV复制。
- 主要证据
- 血清代谢组学鉴定出143种差异代谢物，CA显著上调；体外实验显示25 μg/mL CA显著抑制CEK细胞中IBV N基因和蛋白表达；体内实验显示25和50 mg/kg/d CA显著降低雏鸡气管和肾脏中IBV N基因表达并减轻组织病理损伤；分子动力学模拟显示CA与N蛋白NTD稳定结合。
- 研究意义
- 首次基于代谢组学分析证明CA对IBV感染具有抗病毒作用，为开发抗IBV感染的抗病毒疗法提供了有前景的途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
血清代谢组学分析
分析IBV感染后血清代谢物变化，鉴定差异代谢物及关键代谢通路。
于7 DPI采集血清样本，使用UPLC-MS/MS进行非靶向代谢组学分析，通过多变量统计和KEGG富集分析筛选差异代谢物。
细胞毒性评估
确定CA对CEK细胞的非毒性浓度。
CEK细胞分别用不同浓度CA处理48 h，CCK8法检测细胞活力，计算CC50。
体外抗病毒实验
评估CA对IBV在CEK细胞中复制的影响。
CEK细胞感染IBV（MOI=1），并用不同浓度CA处理，24 h后检测病毒N基因mRNA和蛋白表达，以及病毒滴度。
体内抗病毒实验
评估CA在雏鸡体内对IBV复制和组织病理变化的影响。
14日龄SPF雏鸡感染IBV，同时通过饮水给予不同剂量CA，5天后检测气管和肾脏中的病毒载量并进行组织病理学检查。
分子对接与分子动力学模拟
预测CA与IBV N蛋白的结合模式及稳定性。
使用MOE软件将CA与IBV N蛋白的NTD（PDB: 2BTL）和CTD（PDB: 2GE7）进行分子对接，并进行100 ns分子动力学模拟评估结合稳定性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Procell | -- |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素、链霉素和庆大霉素 | Solarbio | -- | |
| 药物处理 | 肉桂酸 | Solabao | -- |
| ELISA检测 | HRP标记的山羊抗鸡IgY二抗 | -- | -- |
| 酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞毒性检测 | 细胞计数试剂盒-8 | -- | -- |
| Quant通用酶标仪 | Biotex | -- | |
| Western blot | 兔多克隆IBV N蛋白抗体 | 实验室自制 | -- |
| 小鼠单克隆抗GAPDH抗体 | Abmart | -- | |
| HRP标记的山羊抗兔IgY二抗 | Abmart | -- | |
| 山羊抗小鼠IgY二抗 | Abmart | -- | |
| 病毒载量检测 | SYBR Premix Ex Taq™试剂盒 | Vazyme | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | SPF雏鸡的周龄（17日龄用于代谢组学，14日龄用于体内药效）；感染途径（眼鼻接种）；病毒株（GX-YL5）及接种剂量（0.2 mL 10^6或10^5 EID50） 阅读提示：见2.2节和2.7节 |
| 血清代谢组学 | 采样时间（7 DPI）；血清样本数量（每组6个）；UPLC-MS/MS平台及软件数据库；差异代谢物筛选标准（p<0.05, VIP>1） 阅读提示：见2.4节和3.2节 |
| 体外抗病毒实验 | 细胞类型（CEK）；MOI（1.0）；CA浓度（0, 6.25, 12.5, 25 μg/mL）；处理时间（24h）；检测指标（N基因mRNA、N蛋白、病毒滴度） 阅读提示：见2.6节和3.5节 |
| 体内抗病毒实验 | 动物分组（空白对照、CA-0、CA-10、CA-25、CA-50）；CA给药方式（饮水）；剂量（10, 25, 50 mg/kg/d）；给药时间（连续5天）；检测时间（停药后第二天） 阅读提示：见2.7节和3.6节 |
| 分子模拟 | 蛋白结构（NTD: PDB 2BTL, CTD: PDB 2GE7）；对接软件（MOE2019）；MD模拟时间（100 ns）及重复数（3次） 阅读提示：见2.10节、2.11节和3.7节、3.8节 |