体外细胞活力与焦亡表型检测
评估PTE对小鼠乳腺癌细胞活力的影响，并观察是否诱导焦亡形态。
用不同浓度PTE处理EMT6和4T1细胞，采用CCK8检测细胞活力，显微镜观察细胞形态，透射电镜观察细胞膜损伤，检测LDH释放、IL-1β、IL-18和NLRP3表达。
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紫檀芪通过caspase-3/Gasdermin E信号通路诱导小鼠乳腺癌细胞焦亡并重塑肿瘤免疫微环境
Pterostilbene induces pyroptosis in mouse breast cancer cells through the caspase-3/Gasdermin E signaling pathway and reshapes the tumor immune microenvironment.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK8、LDH、IL-1β、Western blot、免疫荧光、siRNA敲降）、体内动物模型（EMT6移植瘤）及转录组测序和流式细胞术分析，且有功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠乳腺癌细胞系EMT6 小鼠乳腺癌细胞系4T1 EMT6乳腺肿瘤移植瘤小鼠模型
重点核对
PTE浓度：0、20、40、80 μM（体外）；体内剂量见图S1 处理时间：24h、48h、72h（体外） caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK的使用 GSDME siRNA敲降序列及浓度 动物分组和给药方案（见图S1）
摘要
越来越多的证据表明，摄入特定的膳食补充剂可能降低乳腺癌风险。紫檀芪（PTE）是一种天然存在的二苯乙烯类化合物，广泛存在于浆果中，以剂量依赖性方式诱导EMT6和4T1细胞焦亡。此外，si Gasdermin E（GSDME）和Z-DEVD-FMK（一种caspase-3酶活性抑制剂）显著抑制了PTE诱导的这些细胞焦亡。这些发现提示PTE通过caspase-3/GSDME信号通路诱导小鼠乳腺癌细胞焦亡。建立EMT6乳腺癌移植瘤小鼠模型以研究PTE的体内抗肿瘤活性。结果表明，PTE以剂量依赖性方式预防和抑制乳腺肿瘤生长。GO和KEGG注释分析显示，大量差异基因集中于免疫系统。为进一步验证PTE是否通过重塑肿瘤免疫微环境（TIME）抑制肿瘤，我们检测了小鼠外周血、脾脏和乳腺肿瘤中Th细胞、CTL细胞、NK细胞、MDSC细胞、TAMs、Treg细胞和B细胞的比例。发现PTE上调抗肿瘤免疫细胞的比例，下调免疫抑制细胞的比例。总之，PTE通过诱导乳腺癌细胞焦亡、增强抗肿瘤免疫和重塑TIME来抑制乳腺肿瘤生长。因此，本研究对开发PTE及含PTE的功能性食品、膳食补充剂、免疫调节药物和乳腺癌治疗辅助剂具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 紫檀芪（PTE）是否通过caspase-3/GSDME信号通路诱导小鼠乳腺癌细胞焦亡，并通过重塑肿瘤免疫微环境（TIME）抑制乳腺肿瘤生长？
- 核心机制
- PTE通过激活caspase-3，切割GSDME，诱导GSDME-NT形成膜孔，导致细胞焦亡；同时增强抗肿瘤免疫，重塑肿瘤免疫微环境。
- 主要证据
- 体外实验显示PTE以剂量依赖性方式诱导EMT6和4T1细胞焦亡，siGSDME和Z-DEVD-FMK抑制该过程；体内实验中，PTE抑制EMT6移植瘤生长，激活caspase-3/GSDME通路，并上调抗肿瘤免疫细胞比例、下调免疫抑制细胞比例。
- 研究意义
- 研究表明PTE可能用于开发功能性食品、膳食补充剂、免疫调节药物和乳腺癌治疗辅助剂，为乳腺癌的预防和治疗提供潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证GSDME依赖性
探究PTE诱导的焦亡是否依赖于GSDME。
通过Western blot检测GSDME表达和切割，免疫荧光观察GSDME定位，使用siRNA敲低GSDME，观察焦亡形态、细胞活力、LDH释放和IL-1β变化。
验证caspase-3/GSDME通路
探究PTE诱导焦亡是否通过caspase-3激活。
检测caspase-3激活，使用caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK，观察细胞形态、活力、LDH释放、IL-1β和GSDME表达。
体内抗肿瘤效果评估
评估PTE对小鼠乳腺肿瘤生长的预防和治疗作用。
建立EMT6移植瘤模型，给予不同剂量和策略的PTE，测量肿瘤体积和重量，HE染色观察组织病理，Western blot检测caspase-3和GSDME，qPCR检测IL-1β、IL-18和NLRP3。
免疫细胞比例检测
评估PTE对小鼠脾脏、外周血和肿瘤中免疫细胞比例的影响。
通过流式细胞术检测Th、CTL、NK、MDSC、TAMs、Treg和B细胞比例，HE染色观察脾脏病理。
转录组测序分析
探讨PTE对肿瘤免疫微环境的影响。
对肿瘤组织进行转录组测序，进行GO和KEGG富集分析，关注免疫相关通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Procell | -- |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Procell | -- | |
| EMT6细胞 | Procell | -- | |
| 4T1细胞 | Procell | -- | |
| 药物处理 | 紫檀芪 | Yuanye | 537-42-8 |
| 二甲基亚砜 | Sigma | -- | |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂盒 | Selleck | -- |
| LDH检测 | LDH检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| IL-1β检测 | IL-1β检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| 蛋白质提取 | 总蛋白提取试剂盒 | -- | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| Caspase-3抗体 | CST | -- | |
| GSDMA抗体 | -- | -- | |
| GSDMC抗体 | Abclonal | -- | |
| GSDMD抗体 | Wanlei | -- | |
| GSDME抗体 | CST, Abcam, Abclonal | -- | |
| β-actin抗体 | Servicebio | -- | |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔IgG (H+L) | -- | -- |
| 免疫荧光试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | -- | -- |
| siRNA | Chaozhou Hippo Biotechnology | -- | |
| 流式细胞术 | 抗体 | -- | -- |
| 动物实验 | BALB/C小鼠 | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和药物处理 | 细胞系、培养基组成、PTE浓度、处理时间、DMSO溶解浓度 阅读提示：Materials and methods - Cell culture and animal experiments; Figure 1 legend |
| siRNA转染 | siRNA序列、转染试剂、siRNA浓度、转染时间 阅读提示：Materials and methods - Small interfering RNA transfection |
| 体内动物模型 | 动物品系、周龄、体重、细胞接种数量、给药剂量、给药方式、时间点、分组 阅读提示：Materials and methods - Cell culture and animal experiments; Figure S1 |
| 免疫细胞检测 | 样本来源、抗体组合、染色步骤、流式分析门控 阅读提示：Materials and methods - Flow cytometry; Table S1 |
| 转录组测序 | 样本选择、测序平台、分析流程 阅读提示：Materials and methods - Transcriptome sequencing and analysis |