临床样本表达验证
验证RPN1在肝细胞癌组织及外周血单个核细胞中的表达水平。
通过RT-qPCR检测23对HCC及癌旁组织中RPN1的表达，通过RT-qPCR检测196例PBMCs（包括健康、慢性HBV携带、HBV相关肝硬化、HBV相关HCC）中的表达，并通过IHC验证蛋白表达。
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二硫化物凋亡相关基因RPN1通过调控细胞周期抑制肝细胞癌的进展，可能是新的治疗靶点。
Disulfidptosis-related genes RPN1 inhibits the progression of hepatocellular carcinoma by regulating cell cycle, may be a new therapeutic targets.
实验完整度
高包含TCGA/ICGC/GEO生信分析、临床组织及PBMC表达验证、细胞功能实验、细胞周期检测、体内裸鼠成瘤实验等多层级验证，并有机制验证。
主要模型
Huh7肝癌细胞系 HCCLM3肝癌细胞系 Hep3B肝癌细胞系 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
RPN1的敲低和过表达效率验证（RT-qPCR和Western blot） 细胞增殖和迁移功能实验（CCK8、EdU、伤口愈合、Transwell） 细胞周期检测（流式细胞术和Western blot） 体内成瘤实验（Hep3B细胞过表达RPN1） 临床样本验证（23对HCC组织及196例PBMCs）
摘要
背景：肝细胞癌（HCC）是主要的肝癌类型，预后不良。治疗方法包括手术、消融、肝移植和免疫治疗。程序性细胞死亡（PCD）在HCC的发生和治疗中发挥重要作用，而二硫化物凋亡作为一种新型PCD，与肿瘤预后和抗肿瘤免疫相关。本研究旨在探讨二硫化物凋亡相关基因（DRGs）在HCC发生发展中的作用及分子机制。方法：我们利用TCGA数据库构建了一个包含RPN1、SLC7A11和GYS1三个DRGs的HCC预后特征。通过实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测196例患者外周血单个核细胞（PBMCs）中特征基因的mRNA表达水平，并通过RT-qPCR和免疫组织化学（IHC）验证23对HCC组织和癌旁非肿瘤组织中RPN1的表达。此外，通过EdU实验、CCK8实验、伤口愈合实验、transwell实验研究了RPN1在HCC中的作用。通过流式细胞术检测细胞周期的变化，通过Western blot检测细胞周期蛋白（CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin E1）的变化。我们通过皮下注射建立的BALB/c裸鼠HCC模型进行了体内实验。结果：配对HCC组织中RPN1显著上调（p < 0.001）。PBMCs中HCC组的表达也显著高于健康组（p < 0.001）。有趣的是，HBV组和HBV-LC组的RPN1表达高于HBV-HCC组（p < 0.001）。IHC实验证实RPN1在HCC组织中也上调（p < 0.05）。体外实验表明，敲低RPN1促进HCC细胞增殖和迁移，而过表达RPN1抑制这些功能。流式细胞术和Western blot证实，在HCCLM3和Huh7细胞中敲低RPN1导致G0/G1期细胞比例降低，G2/M期细胞比例升高。同时，细胞周期蛋白（CDK1、CDK2、Cyclin D1和Cyclin E1）的表达水平显著升高。在体内，Hep3B细胞中RPN1的过表达可以抑制肿瘤生长。结论：体外和体内实验证实，RPN1的过表达可通过调节细胞周期显著抑制HCC的进展。RPN1可能作为HCC的新治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨二硫化物凋亡相关基因RPN1在肝细胞癌发生发展中的作用及其分子机制。
- 核心机制
- RPN1通过调控细胞周期（影响G0/G1期和G2/M期）抑制肝细胞癌的增殖和迁移。
- 主要证据
- RT-qPCR和IHC证实RPN1在HCC组织中高表达；细胞功能实验显示RPN1过表达抑制增殖和迁移；流式细胞术和Western blot显示RPN1敲低导致细胞周期进展；体内实验显示RPN1过表达抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- RPN1可能作为肝细胞癌新的治疗靶点，为HCC治疗提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能实验
探究RPN1对肝癌细胞增殖和迁移的影响。
在Huh7、HCCLM3细胞中敲低RPN1，在Huh7、Hep3B细胞中过表达RPN1，并通过CCK8、EdU、伤口愈合、Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力。
细胞周期机制分析
探究RPN1调控细胞增殖的机制。
通过RNA-seq分析敲低RPN1后的差异表达基因及富集通路，通过流式细胞术检测细胞周期分布，通过Western blot检测周期蛋白表达。
体内动物实验
验证RPN1过表达对肿瘤生长的影响。
在BALB/c裸鼠皮下接种过表达RPN1的Hep3B细胞或对照细胞，测量肿瘤体积和重量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
体内实验
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 病毒感染 | 嘌呤霉素 | Biosharp | -- |
| RNA提取 | RNAkeyTM 试剂 | Sevenbio | SM129-02 |
| RT-qPCR | All-in-one 第一链cDNA合成试剂盒II | Sevenbio | SM129-02 |
| SYBR Green 预混液 | Sevenbio | SM143-01 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Sevenbio | SW101-02 | |
| ECL检测试剂盒 | Sevenbio | SW134-01 | |
| ChemiScope成像系统 | Clinx | -- | |
| RPN1抗体 | Absin | abs143360 | |
| Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| β-actin抗体 | Abways | AB0035 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（HRP） | Immunoway | RS0001 | |
| 山羊抗兔IgG H&L（HRP） | Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology CO., LTD | ZB-2301 | |
| ELISA | HBsAg和HBeAg检测试剂盒 | Wantai BioPharm | -- |
| EdU实验 | BeyoClick™ EdU-555试剂盒 | Beyotime | -- |
| CCK8实验 | 细胞计数试剂盒-8 | Sevenbio | SC119-01 |
| Transwell | 8 μm细胞小室Transwell板 | Biofil | -- |
| RNA-seq | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| TruSeq RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Qubit 2.0荧光计 | Life Technologies | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本验证 | RPN1在HCC组织和PBMCs中的表达水平，样本配对和分组信息。 阅读提示：Material and methods 中的 Clinical specimen 和 Results 中的 RPN1 is upregulated in HCC (Fig.6)。 |
| 细胞培养及病毒感染 | 细胞系来源，培养基，病毒载体（shRNA和过表达）及感染效率。 阅读提示：Material and methods 中的 Cell culture 和 Virus infection。 |
| 细胞功能实验 | 敲低和过表达效率，细胞增殖和迁移测定条件。 阅读提示：Material and methods 中的 EdU assay, CCK8 assay, wound healing test, transwell assay 和 Results 中的相应部分 (Fig.7-9)。 |
| 细胞周期分析 | 细胞周期分布和周期蛋白表达变化。 阅读提示：Material and methods 中的 Cell cycle analysis assay 和 Results 中的 Knockdown of RPN1 promotes cell cycle progression (Fig.11)。 |
| 体内实验 | 小鼠品系、周龄、性别，细胞注射数量和部位，肿瘤测量时间。 阅读提示：Material and methods 中的 Animal study 和 Results 中的 RPN1 suppresses tumor growth in vivo (Fig.12)。 |