动物模型构建与验证
构建髓系特异性EP4敲除小鼠并验证敲除效率。
通过CRISPR-Cas9生成EP4Flox小鼠，与Lyz2-Cre小鼠杂交获得EP4MKO小鼠，再与ApoE-/-小鼠杂交获得ApoE-/-EP4MKO小鼠；通过qRT-PCR和Western blot确认敲除。
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巨噬细胞EP4缺陷通过CD36介导的脂质摄取和M1极化驱动动脉粥样硬化进展。
Macrophage EP4 Deficiency Drives Atherosclerosis Progression via CD36-Mediated Lipid Uptake and M1 Polarization.
实验完整度
高包含细胞模型（BMDM、HMDM）、动物模型（ApoE-/-EP4MKO小鼠）、转录组学、蛋白质组学、功能验证（泡沫细胞形成、极化）及体内外机制验证。
主要模型
骨髓来源巨噬细胞（BMDM） 人单核细胞来源巨噬细胞（HMDM） ApoE−/−EP4MKO小鼠 ApoE−/−EP4Flox小鼠
重点核对
髓系特异性EP4敲除（EP4MKO）小鼠构建 Western diet喂养16周诱导动脉粥样硬化 CD36抑制剂SSO（25 mg/kg/week）腹腔注射4周 oxLDL（50 μg/mL）处理24小时诱导泡沫细胞 LPS（100 ng/mL）和IFN-γ（20 ng/mL）诱导M1极化
摘要
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，是众多心血管疾病的主要病理基础，全球死亡率高。巨噬细胞通过表型转换和泡沫细胞形成在其发病机制中发挥关键作用。前列腺素E2受体亚型4（EP4）在巨噬细胞表面高表达，参与炎症和脂质代谢等多种病理生理过程。然而，巨噬细胞EP4在动脉粥样硬化进展中的作用仍不清楚。确定巨噬细胞EP4是否通过调节泡沫细胞形成和巨噬细胞极化影响动脉粥样硬化的进展。髓系特异性EP4敲除小鼠（ApoE缺陷背景）喂食西方饮食16周。我们的结果表明，动脉粥样硬化过程中EP4表达显著下调。EP4缺陷加重了动脉粥样硬化斑块形成，并使斑块不稳定。体外研究进一步表明，髓系细胞中EP4缺失促进泡沫细胞形成和M1巨噬细胞极化。转录组学和蛋白质组学分析均显示，EP4可能通过调节巨噬细胞中CD36的表达来调节这些过程，这通过Western blot和qPCR进一步证实。总之，巨噬细胞中EP4受体的缺陷通过上调CD36表达增强泡沫细胞形成和M1极化，从而加速动脉粥样硬化的进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 巨噬细胞EP4是否通过调节泡沫细胞形成和巨噬细胞极化影响动脉粥样硬化的进展？
- 核心机制
- EP4缺失通过上调CD36表达，促进巨噬细胞泡沫细胞形成和M1极化，从而加速动脉粥样硬化。
- 主要证据
- 在ApoE-/-EP4MKO小鼠中，EP4缺陷加剧斑块形成和脂质沉积，减少胶原含量，增加M1标志物表达；在体外，EP4缺陷的BMDM和HMDM中泡沫细胞形成和Dil-oxLDL摄取增加，CD36表达上调；CD36敲低或抑制可逆转这些效应。
- 研究意义
- 靶向EP4-CD36信号轴可能为动脉粥样硬化提供潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
动脉粥样硬化斑块分析
评估EP4缺陷对动脉粥样硬化斑块形成和稳定性的影响。
对小鼠主动脉进行油红O染色、H&E染色、Masson染色，免疫荧光检测α-SMA和CD68。
巨噬细胞极化检测
探究EP4缺陷对巨噬细胞M1/M2极化的影响。
分离BMDM，用LPS/IFN-γ或IL4/IL13刺激，通过流式细胞术、qRT-PCR和Western blot检测标志物。
泡沫细胞形成与脂质摄取
检测EP4缺陷对泡沫细胞形成和oxLDL摄取的影响。
BMDM和HMDM用oxLDL处理，进行油红O染色和Dil-oxLDL摄取实验。
机制研究：CD36表达与功能验证
验证EP4是否通过调节CD36表达影响泡沫细胞形成和极化。
通过转录组和蛋白组学分析筛选CD36，Western blot和qPCR验证；使用CD36 siRNA和SSO抑制剂进行功能验证。
药理学EP4激活实验
确认EP4激活对巨噬细胞极化和泡沫细胞形成的抑制作用。
用CAY10580预处理BMDM，然后刺激极化或oxLDL处理，检测相关指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | CRISPR-Cas9系统 | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Procell | 164210-50 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 315-02 | |
| 药物处理 | CAY10580 | MCE | HY-135259 |
| 泡沫细胞诱导 | 氧化低密度脂蛋白 | Yiyuan biotechnologies | YB-002 |
| 脂质摄取分析 | Dil标记的氧化低密度脂蛋白 | Yiyuan biotechnologies | YB-001 |
| 染色 | 油红O | Servicebio | G1015 |
| 细胞核染色 | Hoechst染料 | Thermo Scientific | H3570 |
| 流式细胞术 | 抗CD16/CD32单克隆抗体 | Invitrogen | 14-0161-85 |
| 抗CD11b-PE-Cy7抗体 | Biolegend | 101216 | |
| 抗F4/80-FITC抗体 | Biolegend | 123108 | |
| 抗CD86-PE抗体 | Biolegend | 105007 | |
| 抗CD206-APC抗体 | Biolegend | 321110 | |
| 基因分型 | 直接小鼠基因分型试剂盒Plus | APExBio | K1027 |
| RNA提取 | Trizol试剂 | -- | -- |
| RNA测序 | NEBNext® UltraTM RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7770 |
| NEBNext® UltraTM 定向RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7760s | |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| 蛋白质电泳 | 考马斯亮蓝R-250 | Bestbio | BB-3720 |
| 蛋白质组学 | nanoElute超高效液相色谱系统 | Bruker | -- |
| timsTOF Pro质谱仪 | Bruker | -- | |
| MaxQuant软件 | Max Planck Institute of Biochemistry | -- | |
| KOALA软件 | Kanehisa Laboratories | -- | |
| 极化诱导 | 脂多糖 | Sigma | -- |
| 干扰素-γ | Peprotech | 315-05 | |
| 白细胞介素-4 | Peprotech | 214-14 | |
| 白细胞介素-13 | Peprotech | 210-13 | |
| 组织学 | Tissue-Tek O.C.T.包埋剂 | SAKURA | 4583 |
| Masson三色染色 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 抗CD68抗体 | Proteintech | 25747-1-AP |
| 抗EP4抗体 | Proteintech | 24895-1-AP | |
| Alexa Fluor 594偶联IgG抗体 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 488偶联IgG抗体 | Abcam | ab150077 | |
| Hoechst染料 | Thermo Scientific | H3570 | |
| Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | Cytiva | SH30256.01B | |
| 正常山羊血清 | Gibco | 16210-64 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | B2064-100G | |
| 抗CD36抗体 | Proteintech | 18836-1-AP | |
| 抗Arg1抗体 | Proteintech | 16001-1-AP | |
| 抗F4/80抗体 | Servicebio | GB113373-100 | |
| 抗α-SMA抗体 | Abcam | ab7818 | |
| Alexa Fluor 594偶联IgG二抗 | Abcam | ab150160 | |
| DAPI染料 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| RT-qPCR | RNeasy试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| PrimeScriptTM反转录试剂盒 | Takara | RR037A | |
| SYBR-Green荧光染料 | Takara | RR820A | |
| Applied Biosystems Q6快速实时荧光定量PCR系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Merck | 539131 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0009 | |
| 抗EP4抗体 | Proteintech | 24895-1-AP | |
| 抗CD36抗体 | Abcam | ab133625 | |
| 抗Arg1抗体 | Proteintech | 16001-1-AP | |
| 抗iNOS抗体 | Abcam | ab178945 | |
| 抗Hsp90抗体 | Abcam | ab203126 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| 增强化学发光检测试剂盒 | Merck | WBKLS0500 | |
| ImageLab软件 | Bio-rad | -- | |
| siRNA转染 | LipofectamineTM RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | 13778150 |
| 动物实验 | 磺基琥珀酰亚胺油酸钠（SSO） | MCE | HY-112847A |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 髓系特异性EP4敲除小鼠的构建方法及基因型确认 阅读提示：Methods 2.1 Animals |
| 动脉粥样硬化诱导 | 西方饮食喂养时间（16周）及饮食组成（40% kcal% Fat, 1.25% Cholesterol, 0.5% Cholic） 阅读提示：Methods 2.1 Animals |
| 巨噬细胞培养 | BMDM分化条件（M-CSF浓度10 ng/mL，时间7天） 阅读提示：Methods 2.3 Macrophage Culture and Treatments |
| 泡沫细胞形成 | oxLDL处理浓度（50 μg/mL）和时间（24小时） 阅读提示：Methods 2.6 Foam Cell Induction and Uptake Assay |
| 巨噬细胞极化 | M1极化刺激物（LPS 100 ng/mL, IFN-γ 20 ng/mL）和M2极化刺激物（IL4 20 ng/mL, IL13 20 ng/mL） 阅读提示：Methods 2.7 Macrophage Polarization |
| CD36机制验证 | CD36 siRNA转染和SSO抑制剂使用剂量（25 mg/kg/week，腹腔注射4周） 阅读提示：Methods 2.13 siRNA Transfection, 2.1 Animals, Figure 7 legend |