构建HAX1敲低/过表达HL-60细胞系
体外验证HAX1对中性粒细胞分化和凋亡的影响。
使用pSicoR-shRNA载体敲低HAX1，PCDH-CMV-HAX1-3Flag过表达，经逆转录病毒感染HL-60细胞，嘌呤霉素筛选或FITC分选。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
HAX1抑制中性粒细胞凋亡并促进其成熟
HAX1 inhibits apoptosis and promotes maturation of neutrophils.
实验完整度
高包含体外细胞模型（HL-60敲低/过表达）、体内条件敲除小鼠模型（Hax1-cKO），并通过流式、集落形成、Western blot、RNA-seq、透射电镜等多层级验证功能与机制。
主要模型
HL-60细胞系（HAX1敲低和过表达） Hax1fl/fl; Lyz2-Cre+条件敲除小鼠（C57BL/6J）
重点核对
HL-60细胞：HAX1敲低和过表达载体构建及慢病毒感染（MOI 100-150，10 μg/mL polybrene） HL-60分化诱导：0.75% DMSO和0.5 μM all-trans-retinoic acid处理4天 小鼠模型：Hax1fl/fl与Lyz2-Cre+杂交，获得髓系特异性敲除 凋亡检测：Annexin V/DAPI染色，JC-1法检测线粒体膜电位 RNA-seq分析：差异基因筛选标准（P<0.05且|log2FC|≥1），KEGG富集分析
摘要
随着中性粒细胞多种功能的不断揭示，阐明调控其分化、发育和凋亡的分子机制对于克服中性粒细胞相关疾病治疗中的局限性至关重要。造血细胞特异性蛋白1相关蛋白X1（HAX1）由常染色体隐性严重先天性中性粒细胞减少症的主要致病基因编码，是深入探索中性粒细胞功能的关键靶点。在我们构建的Hax1髓系敲除C57BL/6J小鼠和稳定转染HAX1敲低HL-60细胞中，结果显示粒细胞-单核细胞前体细胞（GMPs）的分化和中性粒细胞的成熟受到抑制，骨髓和外周血中髓系细胞和中性粒细胞的比例显著降低。此外，HAX1缺失破坏了中性粒细胞线粒体结构和线粒体膜电位，并增加了B细胞淋巴瘤2（BCL-2）家族成员和cleaved Caspase-9的蛋白水平。通过RNA测序和mRNA验证，我们进一步证明HAX1通过线粒体介导的经典凋亡通路和Toll样受体2（TLR2）介导的富嘌呤盒1（PU.1）信号调控中性粒细胞凋亡和成熟。本研究阐明了HAX1在中性粒细胞分化、成熟和凋亡中的关键作用，为中性粒细胞相关疾病的研究提供了新靶点。补充信息：在线版本包含补充材料，可在10.1186/s12964-025-02353-2获取。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HAX1在体内外是否调控中性粒细胞成熟和凋亡，其分子机制是什么？
- 核心机制
- HAX1通过线粒体介导的经典凋亡通路（调节BCL-2家族蛋白和Caspase-9）调控凋亡，并经由TLR2介导的PU.1信号途径影响中性粒细胞成熟。
- 主要证据
- HL-60细胞敲低/过表达实验、Hax1-cKO小鼠模型、流式细胞术、集落形成实验、Western blot、透射电镜、RNA测序及mRNA验证。
- 研究意义
- 揭示了HAX1在中性粒细胞成熟和凋亡中的新作用，为中性粒细胞相关疾病（如急性髓系白血病）提供了潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HL-60向中性粒细胞分化诱导及检测
评估HAX1对早幼粒细胞向中性粒细胞分化的影响。
使用DMSO和ATRA诱导HL-60分化4天，通过Wright-Giemsa染色和CD11b流式分析分化比例。
构建Hax1髓系特异性敲除小鼠模型
在体内验证HAX1对中性粒细胞成熟和髓系分化的影响。
将Hax1fl/fl小鼠与Lyz2-Cre+小鼠杂交，获得Hax1-cKO小鼠，通过基因型鉴定和Western blot/RT-qPCR确认敲除效率。
体内髓系分化及中性粒细胞成熟分析
检测HAX1缺失对骨髓和外周血中髓系细胞及中性粒细胞发育的影响。
通过血常规、流式细胞术分析骨髓和外周血中的粒细胞、单核细胞、中性粒细胞各阶段，以及祖细胞比例；通过集落形成实验检测CFU-GM, BFU-E, CFU-GEMM。
凋亡相关蛋白及线粒体功能检测
验证HAX1是否通过线粒体介导的凋亡通路调控中性粒细胞凋亡。
通过Western blot检测BAX, cleaved Caspase-9, Caspase-9水平；透射电镜观察线粒体超微结构；JC-1法检测线粒体膜电位。
RNA测序及下游机制验证
探索HAX1调控中性粒细胞凋亡和成熟的分子机制。
对骨髓髓系祖细胞和终末分化细胞进行RNA测序，分析差异表达基因、KEGG富集及蛋白相互作用，并通过RT-qPCR验证关键基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | Life Technologies | 12440053 |
| 胎牛血清 | Life Technologies | A5670701 | |
| DMEM培养基 | Cytiva | SH30022.01 | |
| HL-60细胞 | Procell | CL-0110 | |
| HEK293T细胞 | -- | -- | |
| Hela细胞 | Procell | CL-0005 | |
| 载体构建 | pSicoR载体 | Addgene | 11579 |
| PCDH-CMV-HAX1-3Flag-EF1a-CopGFP-T2A-Puro过表达载体 | SyngenTech | -- | |
| 病毒包装 | 逆转录病毒包装质粒 | Addgene | 12260 |
| 逆转录病毒包装质粒 | Addgene | 12259 | |
| 病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Life Technologies | A1113803 |
| 细胞分化 | 二甲基亚砜 | Solarbio | D8371 |
| 全反式维甲酸 | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| 凋亡检测 | PE-Annexin V | -- | -- |
| BV421-DAPI | -- | -- | |
| 流式分析 | APC/Cy7-CD11b抗体 | -- | -- |
| FACSAria II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| JC-1线粒体膜电位流式检测试剂盒 | MedChemExpress | -- | |
| 集落形成实验 | 甲基纤维素培养基 | STEMCELL | 03434 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 近红外成像系统Odyssey CLx | LI-COR Biosciences | -- | |
| Image Studio Lite 5.2.5软件 | -- | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026CN |
| PrimeScript RT Master Mix试剂盒 | TaKaRa | RR036A | |
| TB Green PCR试剂盒 | TaKaRa | RR820A | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分化 | HL-60细胞培养条件（IMDM+20% FBS）、分化诱导剂浓度（0.75% DMSO和0.5 μM ATRA）及处理时间（4天） 阅读提示：Methods: Cell lines, Morphological and apoptotic analysis |
| 病毒转导与筛选 | MOI（100-150）、polybrene浓度（10 μg/mL）、嘌呤霉素浓度（4-10 μg/mL）及筛选时间（72小时后开始筛选） 阅读提示：Methods: Expression plasmid production and retroviral infection |
| 小鼠模型构建 | 小鼠品系（C57BL/6J）、年龄（约10周）、Hax1fl/fl与Lyz2-Cre+杂交策略，以及基因型确认方法 阅读提示：Methods: Mice, Results: Fig.2 |
| 流式细胞术分析 | 用于中性粒细胞亚群和祖细胞分析的抗体组合（详见补充表S2）、样本制备（骨髓和外周血）、计数方法（绝对计数管） 阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis, Results: Fig.3 |
| 凋亡与线粒体检测 | 蛋白检测目标（BAX、cleaved Caspase-9等）、JC-1染色条件（37℃ 30分钟）及透射电镜样本处理 阅读提示：Methods: Western blot, Morphological and apoptotic analysis; Results: Fig.5 |