临床样本和TCGA数据中RUNX2异构体表达分析
评估RUNX2异构体II在OSCC中的表达水平及其与临床病理特征和预后的关系
使用TCGA数据库分析RUNX2总表达和异构体PSI值，并在11例OSCC组织和11例正常组织中进行RT-PCR验证；比较不同临床分期患者的异构体II表达，并进行生存分析
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RUNX2异构体II通过促进PRDX2表达保护口腔鳞状细胞癌细胞免于铁死亡和凋亡
RUNX2 isoform II protects cancer cells from ferroptosis and apoptosis by promoting PRDX2 expression in oral squamous cell carcinoma.
实验完整度
高包括TCGA及临床样本表达分析、细胞增殖与凋亡检测、铁死亡功能验证（ROS、脂质过氧化、线粒体形态）、ChIP-qPCR机制验证及裸鼠成瘤实验等独立证据层级。
主要模型
CAL 27细胞系 SCC-9细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 OSCC患者组织样本
重点核对
CAL 27和SCC-9细胞系，经STR鉴定 RUNX2异构体II特异性siRNA（si-II-1、si-II-2）或shRNA敲低 铁死亡抑制剂Fer-1（10 μM）和凋亡抑制剂Z-VAD（20 μM）处理浓度 裸鼠皮下注射3.5×10^5细胞，每组6只 ChIP-qPCR使用抗FLAG抗体验证PRDX2启动子结合
摘要
铁死亡是一种独特的铁依赖性程序性细胞死亡，在肿瘤抑制中发挥重要作用。然而，铁死亡的调控机制仍需进一步探索。RUNT相关转录因子2（RUNX2）是一种转录因子，对成骨至关重要。RUNX2由两个替代启动子产生两种类型的转录本。在本研究中，我们惊奇地发现RUNX2异构体II是一种新型的铁死亡和凋亡抑制因子。RUNX2异构体II可以结合过氧化物还原酶-2（PRDX2，一种铁死亡抑制剂）的启动子并激活其表达。敲低RUNX2异构体II在体外抑制口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞增殖，并在体内抑制肿瘤发生。有趣的是，同源盒A10（HOXA10）作为RUNX2异构体II的上游正调控因子，是通过RUNX2异构体II/PRDX2通路抑制铁死亡和凋亡所必需的。一致地，RUNX2异构体II在OSCC中过表达，并与OSCC进展和不良预后相关。总之，OSCC癌细胞可以通过新的HOXA10/RUNX2异构体II/PRDX2通路上调RUNX2异构体II以抑制铁死亡和凋亡，促进肿瘤发生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RUNX2异构体II在OSCC中是否通过调控PRDX2影响铁死亡和凋亡，以及其上游调控机制。
- 核心机制
- RUNX2异构体II作为转录因子结合PRDX2启动子并激活其表达，PRDX2抑制铁死亡和凋亡；HOXA10作为上游正调控因子促进RUNX2异构体II表达，形成HOXA10/RUNX2异构体II/PRDX2通路。
- 主要证据
- TCGA和临床样本显示RUNX2异构体II高表达且与不良预后相关；敲低RUNX2异构体II增加ROS和脂质过氧化、诱导凋亡、抑制体内肿瘤生长，而PRDX2过表达可部分逆转这些效应；ChIP-qPCR证实RUNX2异构体II结合PRDX2启动子。
- 研究意义
- 揭示了铁死亡调控的新机制，并可能为OSCC提供新的诊断标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RUNX2异构体II功能获得和缺失实验
验证RUNX2异构体II对OSCC细胞增殖和凋亡的影响
在CAL 27和SCC-9细胞中过表达异构体II或I，或敲低异构体II，检测细胞增殖、集落形成和凋亡
体内异种移植瘤模型验证
验证RUNX2异构体II对OSCC肿瘤生长的影响
将稳定敲低异构体II的CAL 27细胞皮下注射到裸鼠背部，测量肿瘤体积和重量
铁死亡表型检测
探究RUNX2异构体II是否影响铁死亡
检测敲低或过表达异构体II后细胞ROS水平、脂质过氧化、线粒体形态及OCR变化，并用铁死亡抑制剂Fer-1进行回补实验
PRDX2作为RUNX2异构体II下游靶标的验证
验证RUNX2异构体II是否通过调控PRDX2表达影响铁死亡和凋亡
通过RT-PCR筛选铁死亡相关基因，检测PRDX2表达变化；ChIP-qPCR验证RUNX2异构体II与PRDX2启动子结合；PRDX2过表达回补实验检测ROS、脂质过氧化和凋亡
HOXA10作为上游调控因子的验证
探究HOXA10是否调控RUNX2异构体II表达并影响OSCC细胞铁死亡和凋亡
敲低HOXA10后检测RUNX2异构体II和PRDX2表达变化，分析细胞增殖、凋亡、ROS和脂质过氧化，并通过过表达异构体II进行回补
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Vital River | Strain |
| 细胞培养 | CAL 27细胞系 | -- | -- |
| SCC-9细胞系 | -- | -- | |
| HEK 293T细胞系 | Procell | CL-0005 | |
| DMEM培养基 | Hyclone | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | -- | |
| DMEM/F12培养基 | Hyclone | -- | |
| 氢化可的松 | Sangon Biotech | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000001 | |
| 聚凝胺 | Santa Cruz | sc-134120 | |
| RUNX2异构体II shRNA | Vector Builder | VB221206-1024udv; | |
| PRDX2 shRNA | Vector Builder | VB900064-6571eqq; | |
| 阴性对照shRNA | Vector Builder | VB010000-009mxc | |
| 异构体II siRNA | Sangon Biotech | -- | |
| HOXA10 siRNA | GenePharma | -- | |
| 阴性对照siRNA | Sangon Biotech | -- | |
| RT-PCR | AxyPrep总RNA提取试剂盒 | Axygen | AP-MN-MS-RNA-250 |
| Maxima H Minus cDNA合成预混液 | Thermo Fisher Scientific | M1682 | |
| Green Taq Mix | Vazyme | P131-AA | |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | 抗RUNX2抗体 | Santa Cruz | SC-390351 |
| 抗FLAG抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| 抗PRDX2抗体 | Proteintech | 10545-2-AP | |
| 抗GPX4抗体 | ABclonal | A11243 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-lg | |
| 免疫组织化学 | 抗4-HNE抗体 | Abcam | ab48506 |
| 抗TFRC抗体 | Abcam | ab214039 | |
| Dako EnVision FLEX试剂盒 | Dako | K8023 | |
| 抗原修复液 | Dako | K8023 | |
| 过氧化物酶封闭剂 | Dako | GV800 | |
| HRP标记二抗 | Dako | K8023 | |
| DAB显色系统 | Dako | K3468 | |
| Pannoramic MIDI扫描仪 | 3D HISRECH | -- | |
| 细胞免疫荧光 | DCFH-DA荧光探针 | Beyotime | S0033S |
| C11-BODIPY 581/591荧光探针 | Thermo Fisher Scientific | D3861 | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | KeyGEN BioTECH | KGA108 |
| 透射电镜 | JEM-1011透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 耗氧率检测 | Seahorse XFe24分析仪 | Agilent | -- |
| XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | 103015-100 | |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| FCCP | -- | -- | |
| 药物处理 | Ferrostatin-1 | MCE | 347174-05-4 |
| RSL3 | MCE | 1219810-16-8 | |
| Z-VAD | Selleck | S7023 | |
| Necrostatin-1 | Selleck | S8037 | |
| ChIP-qPCR | ABclonal超声ChIP试剂盒 | ABclonal | RK20258 |
| 抗FLAG抗体（用于ChIP） | Proteintech | 20543-1-AP | |
| 正常兔IgG | ABclonal | RM20712 | |
| ChIP级蛋白A/G磁珠 | ABclonal | RM02915 | |
| DNA纯化试剂盒 | ABclonal | RK30100 | |
| 细胞培养 | 台盼蓝溶液 | Biosharp | -- |
| 结晶紫 | Servicebio | -- | |
| Matrigel基质胶 | Corning | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | CAL 27和SCC-9细胞的培养条件（DMEM或DMEM/F12、10% FBS、1%抗生素-抗真菌剂，SCC-9额外添加400 ng/mL氢化可的松）；HEK 293T细胞来源 阅读提示：Materials and methods - Cell culture |
| 基因敲低/过表达 | siRNA序列（si-II-1、si-II-2、siHOX-1、siHOX-2）及浓度；shRNA靶序列；慢病毒包装比例（4:3:1）；转染试剂（Lipofectamine 2000/3000） 阅读提示：Materials and methods - Plasmids and transfection, RNA interference and transfection |
| 细胞增殖与凋亡检测 | 细胞计数方法（台盼蓝排除法）及重复数；集落形成实验的细胞接种数和培养时间；凋亡检测试剂盒及流式分析条件 阅读提示：Materials and methods - Cell counting and colony formation assay, Apoptosis assay |
| 铁死亡表型检测 | ROS检测DCFH-DA浓度（10 μM）和孵育时间；脂质过氧化C11-BODIPY浓度（5 μM）和孵育时间；透射电镜的固定液和固定时间；OCR检测细胞数（3×10^4）及化合物浓度（oligomycin 1μM, FCCP 1μM, Rot/AA 1μM） 阅读提示：Materials and methods - ROS detection, Detection of lipid peroxidation, Transmission electron microscopy, Oxygen consumption rate assay |
| 异种移植瘤实验 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠，雌性，5-6周龄）及来源；注射细胞数（3.5×10^5）和注射部位；肿瘤体积计算公式（Length × Width^2 ×0.52）及测量频率 阅读提示：Materials and methods - Nude mice xenograft tumor formation assay |
| ChIP-qPCR | 细胞固定条件（1%甲醛）；抗体量（抗FLAG 2 μg）；染色质剪切条件；PRDX2启动子引物序列 阅读提示：Materials and methods - Chromatin immunoprecipitation and quantitative PCR |