内江猪基因组组装与注释
获得高质量的中国地方猪参考基因组，为后续变异检测和进化分析提供基准。
使用PacBio长reads和Hi-C技术组装内江猪染色体级别基因组，并进行重复序列注释、基因预测和功能注释。
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中国不同猪品种体长的纬度驱动适应性进化
Latitude-driven adaptive evolution of body length in diverse pig breeds across China.
实验完整度
高包含基因组组装、群体遗传学分析、选择信号扫描、基因渐渗分析及AFF4过表达/敲低的功能验证和机制研究，证据层级独立且完整。
主要模型
内江猪 猪脂肪间充质干细胞（ADSCs） 23个低海拔中国地方猪品种群体
重点核对
体长与纬度相关性：Spearman相关系数为0.815 (P=2.19e-06) AFF4基因过表达后，RUNX2、OPN、OSX表达显著上调 AFF4基因敲低后，RUNX2、OPN、OSX表达显著抑制 ALP染色定量：过表达组染色增强，敲低组染色减弱
摘要
背景：中国猪的地理分化通过适应性进化产生了多种表型。尤其是来自相对低海拔地区的猪，其体长与纬度呈正相关。然而，这种关系背后的分子机制仍不清楚。鉴定与这种体长变异相关的候选基因对于进一步理解这些中国猪品种适应性性状的遗传基础至关重要。结果：我们组装了一个高质量的内江猪基因组作为基准，并分析了分布在不同纬度的297头中国家猪和6头中国野猪。我们的研究提供了遗传多样性和种群结构的全面评估，揭示了来自不同地区的中国本土猪具有不同的遗传背景。最重要的是，我们观察到纬度与体长之间存在很强的相关性，并通过四种计算方法筛选出AFF4基因。同时，AFF4在低海拔猪品种中的基因渐渗和单倍型分化也证明AFF4可能是影响猪体长适应性进化的驱动基因之一。我们在研究中进行了过表达和敲低实验，并确认了AFF4对成骨分化过程的显著影响。结论：这些结果丰富了猪基因组库，为中国猪品种的遗传结构提供了全面的理解，并揭示了纬度与中国猪体长适应性进化之间的相关性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 中国地方猪品种体长随纬度变化的适应性进化的遗传机制是什么？
- 核心机制
- AFF4基因作为超延伸复合物的核心成分，可能通过调控表观遗传机制影响成骨相关基因的表达，从而促进成骨分化，驱动猪体长的适应性进化。
- 主要证据
- 通过GWAS、FST、π、XP-CLR四种方法筛选出AFF4基因；基因渐渗和单倍型分析显示AFF4在不同体长猪品种间存在差异；过表达和敲低实验证实AFF4显著影响猪ADSCs的成骨分化。
- 研究意义
- 研究丰富了猪基因组资源，为中国猪品种的遗传结构提供了全面理解，并揭示了AFF4基因在猪体长适应性进化中的重要作用，为理解适应性进化机制提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
群体遗传多样性与结构分析
评估中国地方猪品种的遗传多样性和种群结构，揭示地理分布与遗传背景的关系。
对297头中国家猪和6头中国野猪进行全基因组重测序，计算核苷酸多样性、LD衰减、有效种群大小，并进行系统发育树、PCA和ADMIXTURE分析。
体长与纬度关联分析及选择信号扫描
鉴定与体长适应性进化相关的候选基因。
收集23个低海拔猪品种的体长数据，进行Spearman相关性分析；将体型极端大的猪和极端小的猪分组，使用FST、π、XP-CLR和GWAS扫描选择信号。
AFF4基因渐渗与单倍型分析
验证AFF4基因在猪品种间的渐渗模式和单倍型分化，进一步支持其作为体长候选基因。
使用fd统计量检测AFF4区间内的基因渐渗，进行单倍型块分析和单倍型分布作图，并通过ILS分析排除不完全谱系分选的影响。
AFF4基因功能验证
验证AFF4基因对成骨分化的影响，支持其在体长发育中的作用。
在猪脂肪间充质干细胞（ADSCs）中过表达和敲低AFF4，检测成骨分化标志基因RUNX2、OPN、OSX的表达，并进行ALP染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因组组装 | Pacbio Sequel II平台 | -- | -- |
| Hi-C文库制备与测序 | MboI | -- | -- |
| 基因组组装 | Hifiasm | -- | -- |
| Purge-Haplotigs | -- | -- | |
| Juicer | -- | -- | |
| 3D-DNA | -- | -- | |
| 重复序列注释 | RepeatMasker | -- | -- |
| RepeatProteinMask | -- | -- | |
| RepeatModeler | -- | -- | |
| LTRharvest | -- | -- | |
| 基因注释 | GeMoMa | -- | -- |
| 基因功能注释 | Blast | -- | -- |
| 基因家族分析 | OrthoFinder | -- | -- |
| 基因家族进化分析 | MCMCTREE | -- | -- |
| 基因家族扩张收缩分析 | CAFÉ | -- | -- |
| 比较基因组分析 | MUMmer | -- | -- |
| 全基因组重测序 | Covaris | -- | -- |
| SOAPnuke | -- | -- | |
| 比对 | BWA-MEM | -- | -- |
| SAMtools | -- | -- | |
| 变异检测 | GATK | -- | -- |
| 变异注释 | SnpEff | -- | -- |
| 遗传多样性分析 | VCFtools | -- | -- |
| PopLDdecay | -- | -- | |
| SMC++ | -- | -- | |
| PLINK | -- | -- | |
| 系统发育分析 | FastME | -- | -- |
| 群体结构分析 | ADMIXTURE | -- | -- |
| 基因流分析 | TreeMix | -- | -- |
| Dsuite | -- | -- | |
| 选择信号扫描 | XP-CLR | -- | -- |
| GEMMA | -- | -- | |
| 单倍型分析 | LDBlockShow | -- | -- |
| pheatmap | -- | -- | |
| 分化时间推断 | MAFFT | -- | -- |
| trimAl | -- | -- | |
| BEAST | -- | -- | |
| Tracer | -- | -- | |
| 细胞培养 | Procell Life Science | Procell Life Science | -- |
| STEMCELL | STEMCELL | -- | |
| 基因过表达 | pUC57载体 | Sangon Biotech | -- |
| Lipofectamine3000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 基因敲低 | siRNA | Sangon Biotech | -- |
| 定量RT-PCR | RNAiso试剂 | TaKara | -- |
| PrimerScript RT试剂盒 | Takara | -- | |
| CFX Connect实时荧光定量PCR系统 | -- | -- | |
| ALP染色 | ALP试剂盒 | Servicebio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因组组装 | PacBio测序数据量84.43 Gb，Hi-C数据量402.62 Gb，组装软件及参数（Hifiasm默认参数、Purge-Haplotigs参数-l 7 -m 65 -h 155 -j 10 -s 80） 阅读提示：Methods: Genome sequencing, Hi-C library preparation and sequencing, NJ pig draft genome assembly |
| 群体遗传分析 | 样本数量（297头家猪和6头野猪），SNP过滤参数（-min-alleles 2 -max-alleles 2 -maf 0.01 -max-missing 0.9 -min-meanDP 3），π计算窗口（100,000 bp），LD衰减最大距离（500 kb），SMC++参数（突变率2.5e-8，世代时间5年） 阅读提示：Methods: Whole genome resequencing, read mapping, and variant calling; Genetic diversity |
| 选择信号扫描 | 分组标准（体长>135cm为大型组，<95cm为小型组），FST和π计算窗口（20-kb windows，10-kb steps），阈值（top 1%），XP-CLR阈值（top 0.1%），GWAS显著性阈值（-log10(p)=5） 阅读提示：Methods: Selection scan for body length |
| 基因渐渗分析 | fd统计量计算参数（-w 50,10），阈值（top 5%），ILS分析参数（重组率0.95 cM/Mb，世代时间3年） 阅读提示：Methods: Selection scan for body length; Divergence time inference; Incomplete lineage sorting |
| AFF4功能验证 | 细胞类型（猪ADSCs），过表达载体（pUC57），敲低试剂（siRNA），转染试剂（Lipofectamine3000），转染时间（48小时），成骨诱导时间（2、5、7天），ALP染色时间（第7天），qRT-PCR参考基因（GAPDH） 阅读提示：Methods: Cell culture; Gene knockdown and overexpression; Quantitative RT-PCR; ALP staining |