建立LPS耐受巨噬细胞模型
诱导并验证LPS耐受巨噬细胞的免疫抑制表型。
使用THP-1细胞经PMA诱导分化为巨噬细胞，或用GM-CSF从PBMC分化巨噬细胞，通过单次或连续LPS刺激建立LPS刺激和LPS耐受模型，并通过CCK-8、流式细胞术、RT-qPCR和ELISA验证细胞活力、凋亡、极化及炎症因子水平。
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SPI1上调LILRB2通过抑制TLR8介导的MyD88/NF-κB信号增强LPS耐受巨噬细胞的免疫抑制表型
SPI1 upregulated LILRB2 to enhance the immunosuppressive phenotype of LPS-tolerant macrophages by inhibiting TLR8-mediated MyD88/NF-κB signaling.
实验完整度
中实验中包含体外细胞模型、功能验证（CCK-8、凋亡、极化）和机制验证（Co-IP、ChIP、双荧光素酶），但缺乏动物模型和临床样本验证。
主要模型
THP-1细胞衍生的巨噬细胞 人外周血单核细胞衍生的巨噬细胞
重点核对
LPS处理浓度10 ng/mL及单次或连续刺激 LILRB2敲低和过表达效率验证 SPI1敲低和过表达对LILRB2表达的影响 TLR8激动剂VTX-2337（1 µg/mL）处理
摘要
在脓毒症中，免疫抑制通常表现为巨噬细胞的脂多糖（LPS）耐受。白细胞免疫球蛋白样受体B2（LILRB2）是免疫细胞上的抑制性受体，可能在LPS耐受巨噬细胞的免疫抑制表型中发挥关键作用，尽管其在脓毒症中的确切功能仍不清楚。在本研究中，巨噬细胞接受单次或连续LPS刺激以诱导LPS刺激或耐受。使用CCK-8法评估细胞活力，通过流式细胞术检测细胞凋亡和巨噬细胞极化，通过RT-qPCR和ELISA测量促炎细胞因子水平。使用Co-IP、ChIP和双荧光素酶实验探索分子相互作用，而mRNA和蛋白表达通过RT-qPCR和Western blotting评估。结果显示，LPS刺激后巨噬细胞中LILRB2上调，在LPS耐受组中增加更显著。敲低LILRB2逆转了LPS耐受巨噬细胞的免疫抑制表型，并恢复了由LPS耐受引起的MyD88/NF-κB信号和p65核转位的抑制。机制上，LILRB2与Toll样受体8（TLR8）相互作用，抑制LPS耐受巨噬细胞中的MyD88/NF-κB信号通路。此外，Spi-1原癌基因（SPI1）的上调通过转录激活LILRB2增强免疫抑制表型。总之，SPI1上调通过激活LILRB2转录促进LPS耐受巨噬细胞的免疫抑制表型，从而抑制TLR8介导的MyD88/NF-κB信号。本研究阐明了LILRB2在LPS耐受巨噬细胞中的作用及其潜在机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LILRB2在LPS耐受巨噬细胞免疫抑制表型中的作用及其机制是什么？
- 核心机制
- SPI1转录激活LILRB2，上调的LILRB2与TLR8相互作用，抑制TLR8介导的MyD88/NF-κB信号通路，从而增强巨噬细胞的免疫抑制表型。
- 主要证据
- 体外巨噬细胞模型（THP-1和PBMC来源）中，LPS耐受诱导LILRB2上调；敲低LILRB2逆转免疫抑制表型并恢复MyD88/NF-κB信号；Co-IP验证LILRB2与TLR8互作；ChIP和双荧光素酶验证SPI1对LILRB2的转录激活。
- 研究意义
- 本研究揭示了脓毒症免疫抑制的新机制，将LILRB2作为逆转巨噬细胞LPS耐受的潜在治疗靶点，为脓毒症免疫抑制治疗提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
敲低或过表达LILRB2
探究LILRB2对LPS耐受巨噬细胞免疫抑制表型的影响。
用慢病毒感染THP-1细胞建立稳定的LILRB2敲低或过表达，然后诱导LPS耐受，检测细胞活力、凋亡、炎症因子和M1极化。
验证LILRB2与TLR8的互作及信号通路
确定LILRB2是否通过TLR8抑制MyD88/NF-κB通路。
通过STRING数据库预测并Co-IP验证LILRB2与TLR8互作，Western blot检测MyD88/NF-κB通路蛋白以及p65核转位。
测试TLR8激动剂对LILRB2诱导表型的逆转
确认LILRB2对免疫抑制表型的作用依赖于TLR8。
在LILRB2过表达的LPS耐受巨噬细胞中，用TLR8激动剂VTX-2337处理，观察细胞活力、凋亡、炎症因子和M1极化是否恢复。
验证SPI1对LILRB2的转录调控
证实SPI1转录激活LILRB2表达。
通过GeneCard预测转录因子，敲低SPI1观察LILRB2表达变化，用JASPAR预测结合位点，并通过ChIP和双荧光素酶报告基因验证。
验证SPI1-LILRB2轴的因果链
确认SPI1通过调控LILRB2影响LPS耐受表型。
在SPI1敲低的基础上过表达LILRB2，观察细胞活力、凋亡、炎症因子、M1极化和MyD88/NF-κB通路是否逆转。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞分化 | 佛波醇酯 | Millipore Sigma | -- |
| 细胞培养 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | BioLegend | -- |
| 分离PBMC | RosetteSep试剂盒 | -- | -- |
| 细胞处理 | 脂多糖 | -- | -- |
| VTX-2337 | -- | -- | |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 慢病毒感染筛选 | 嘌呤霉素 | Thermo Fisher | -- |
| 检测细胞活力 | CCK-8试剂盒 | Dojindo Laboratories | -- |
| 流式细胞术 | Annexin V凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| FACSCanto II | BD | -- | |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| 抗CD86抗体 | Abcam | ab239075 | |
| 抗CD206抗体 | Wuhan Proteintech | 18704-1-AP | |
| ChIP | ChIP试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| SPI1抗体 | Abcam | ab302623 | |
| 双荧光素酶报告基因 | pGL3载体 | Promega | -- |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- | |
| Co-IP | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | -- |
| IgG抗体 | Abcam | ab172730 | |
| LILRB2抗体 | Thermo Fisher Scientific | H00010288-M01 | |
| TLR8抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-135584 | |
| ELISA | TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 核质分离 | NE-PER核质提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript反转录试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | -- | -- | |
| ABI 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | LILRB2抗体 | Thermo Fisher Scientific | H00010288-M01 |
| TLR8抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-135584 | |
| p65抗体 | Abcam | ab32536 | |
| 磷酸化p65抗体 | Abcam | ab7630 | |
| MyD88抗体 | Abcam | ab133739 | |
| 磷酸化TAK1抗体 | Abcam | ab109404 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分化 | THP-1细胞用PMA浓度150 ng/mL处理24小时；PBMC用GM-CSF 5000 U/mL培养 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and differentiation |
| LPS耐受诱导 | LPS浓度10 ng/mL，单次或连续刺激时间均为24小时 阅读提示：Materials and methods: Treatment of LPS-tolerant macrophages; Figure S1 |
| 基因敲低或过表达 | 慢病毒载体(sh-LILRB2, sh-SPI1, LV-LILRB2)的序列及感染效率；嘌呤霉素筛选浓度5 µg/mL，处理5天 阅读提示：Materials and methods: Lentivirus packaging and infection |
| TLR8激动剂处理 | VTX-2337浓度1 µg/mL，处理时间24小时 阅读提示：Materials and methods: Treatment of LPS-tolerant macrophages |
| 检测方法与统计 | 所有实验生物学重复3次；数据分析使用单因素方差分析和Tukey事后检验，显著性水平P<0.05 阅读提示：Materials and methods: Data analysis |