检测ISG15在DKD中的表达
验证ISG15在DKD肾脏和HG处理的TECs中的表达变化
使用qPCR和Western blot检测DKD小鼠（STZ/HFD和db/db）及HG处理的TECs中Isg15 mRNA、ISG15蛋白和ISGylation水平。
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ISG15的升高通过调节肾小管上皮细胞焦亡促进糖尿病肾病
Elevation of ISG15 promotes diabetic kidney disease by modulating renal tubular epithelial cell pyroptosis.
实验完整度
高包含体内DKD小鼠模型（ISG15 KO、db/db）和体外细胞模型（TECs），并进行了功能验证（焦亡、纤维化、炎症）和机制验证（mtDNA–cGAS–STING通路、ISGylation）。
主要模型
ISG15敲除（ISG15 KO）小鼠（C57BL/6背景） STZ/HFD诱导的DKD小鼠模型 db/db糖尿病小鼠模型（C57BLKS/JGpt背景） 小鼠肾小管上皮细胞（TECs）
重点核对
ISG15表达水平：DKD小鼠和HG处理的TECs中ISG15 mRNA和蛋白水平升高 ISG15敲除效果：ISG15 KO小鼠中肾功能、纤维化、炎症和焦亡标志物的变化 HG处理条件：TECs用40 mM d-葡萄糖处理48小时 信号通路激活：cGAS–STING通路蛋白（cGAS、STING、p-TBK1、p-p65）的表达变化 ISGylation依赖性：ISG15野生型与ISG15AA突变体的差异效应
摘要
背景
肾小管上皮细胞（TECs）中的纤维化和炎症是糖尿病肾病（DKD）病理学的关键因素。然而，这些过程的精确触发因素仍不清楚。本研究旨在探讨干扰素刺激基因15（ISG15）在高糖（HG）条件下诱导的TECs损伤中的作用及其对DKD发展的影响。
方法
使用注射链脲佐菌素并喂食高脂饮食的ISG15敲除（ISG15 KO）小鼠来研究其在DKD中的作用。将ISG15敲低的细胞模型暴露于HG条件下，以评估ISG15对细胞反应的影响。随后，我们评估了ISG15对焦亡（一种程序性细胞死亡形式）的影响，以了解其在DKD病理中的潜在作用。此外，采用RNA测序（RNA-seq）和分子生物学技术来探索ISG15可能调节的信号通路。
结果
我们首先证实了DKD中肾小管内ISG15的上调。ISG15的缺失减轻了肾功能损伤、纤维化和炎症，这与ISGylation水平降低相关。机制研究发现，HG刺激TECs破坏了mtDNA–cGAS–STING信号，通过NLRP3–CASP1–GSDMD轴加剧DKD。此外，我们发现了STING和ISG15之间的双向调节回路，STING上游增强ISG15表达，而ISG15通过ISGylation调节STING表达。
结论
ISG15–mtDNA–STING成为整合焦亡、纤维化和炎症过程的关键枢纽。针对这一信号网络在不同水平上的治疗干预可能为DKD的创新治疗铺平道路。
关键点
-
ISG15在DKD小鼠和高糖培养的肾小管上皮细胞中高表达。
-
ISG15通过NLRP3–CASP1–GSDMD轴促进DKD焦亡。
-
ISG15–mtDNA–STING成为整合焦亡过程的关键枢纽。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ISG15在糖尿病肾病（DKD）肾小管上皮细胞损伤中的作用及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- ISG15通过ISGylation调节mtDNA–cGAS–STING信号通路，促进NLRP3–CASP1–GSDMD轴介导的焦亡，从而加剧DKD中的纤维化和炎症。
- 主要证据
- ISG15在DKD小鼠和HG处理的TECs中高表达；ISG15缺失减轻肾损伤、纤维化和炎症；机制研究显示ISG15通过ISGylation影响mtDNA释放和STING通路激活。
- 研究意义
- ISG15–mtDNA–STING轴是整合焦亡、纤维化和炎症的关键枢纽，靶向该信号网络可能为DKD提供新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估ISG15缺失对DKD小鼠的保护作用
确定ISG15缺失对DKD小鼠肾功能、纤维化和炎症的影响
使用ISG15 KO小鼠，通过STZ/HFD诱导DKD，检测肾功能指标（BUN、UAER）、组织学染色（PAS、Masson）和纤维化/炎症标志物。
验证ISG15在TECs焦亡中的作用
探究ISG15是否通过调节焦亡影响TECs损伤
在HG处理的TECs中敲低ISG15，检测焦亡相关蛋白（NLRP3、CASP1、GSDMD）、Annexin V/PI双阳性率、LDH释放、IL-18和ROS水平。
验证GSDMD和NLRP3在ISG15诱导的TECs损伤中的必要性
确定ISG15通过NLRP3–CASP1–GSDMD轴促进TECs损伤和纤维化
通过siRNA敲低GSDMD或使用NLRP3抑制剂MCC950，检测ISG15过表达或HG处理下的焦亡、纤维化和炎症指标。
评估ISG15对线粒体功能和mtDNA释放的影响
探究ISG15是否通过破坏线粒体稳态促进mtDNA释放
检测线粒体膜电位（JC-1）、线粒体质量（MitoTracker）、mtROS（MitoSOX）、mtDNA拷贝数及亚细胞分布。
验证cGAS–STING通路的激活
评估cGAS–STING通路在DKD和HG条件下的激活状态及其在ISG15调节中的作用
通过Western blot检测cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-p65/p65水平；使用STING抑制剂C-176处理TECs，检测焦亡、纤维化和炎症变化。
验证ISG15与STING的反馈回路
探究ISG15和STING之间的双向调控关系及其在维持TECs损伤中的作用
在TECs中敲低ISG15并过表达STING，或过表达ISG15并抑制STING，检测cGAS–STING通路和焦亡、纤维化、炎症标志物。
确认ISG15效应的ISGylation依赖性
确定ISG15是通过ISGylation而非单体形式发挥功能
比较过表达ISG15野生型、ISG15AA突变体（不能结合）或空载体对cGAS–STING通路和焦亡、纤维化、炎症标志物的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | ISG15敲除小鼠 | Cyagen Biosciences | -- |
| db/db小鼠 | GemPharmatech | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Biosharp | -- |
| 胎牛血清 | Viva cell | -- | |
| D-葡萄糖 | Sigma | -- | |
| 甘露醇 | Sigma | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| siRNA合成 | 小干扰RNA | TSINGKE Biotech | -- |
| 质粒构建 | 质粒 | miaolingbio | -- |
| 药物处理 | Mito-TEMPO | TargetMol | -- |
| MCC950 | TargetMol | -- | |
| C-176 | TargetMol | -- | |
| 流式分析 | MitoTracker线粒体探针 | Beyotime | -- |
| MitoSOX Red线粒体超氧化物指示剂 | YEASEN | -- | |
| JC-1染料 | Beyotime | -- | |
| DCFH-DA活性氧探针 | Beyotime | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Meilunbio | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V/PI检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| LDH释放检测 | LDH检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| NLRP3抗体 | ZEN-BIOSCIENCE | -- | |
| CASP1抗体 | BOSTER | -- | |
| GSDMD抗体 | HuaBio | -- | |
| Cleaved caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| STING抗体 | Proteintech | -- | |
| cGAS抗体 | Abclone | -- | |
| TBK1抗体 | Proteintech | -- | |
| p-TBK1抗体 | Proteintech | -- | |
| p65抗体 | absin | -- | |
| p-p65抗体 | absin | -- | |
| ISG15抗体 | BOSTER | -- | |
| 山羊抗兔IgG | HuaBio | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Beyotime | -- | |
| RNA提取 | HiPure组织RNA小提试剂盒 | Magen | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green荧光染料 | Vazyme | -- |
| 引物 | Sangon Biotech | -- | |
| RNA测序 | Illumina Novaseq6000测序平台 | Illumina | -- |
| RNA质量评估 | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| DNA提取 | TIANamp基因组DNA试剂盒 | TIANGEN | -- |
| 动物实验 | 链脲佐菌素 | -- | -- |
| 腺相关病毒9型 | GenePharma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DKD小鼠模型建立 | STZ注射剂量（60 mg/kg）和频率（5天），高脂饮食（60%脂肪热量），ISG15 KO遗传背景（C57BL/6） 阅读提示：参见Materials and Methods 2.1节 |
| 细胞培养与HG处理 | TECs培养基（DMEM/F12含5% FBS），HG浓度（40 mM），处理时间（48小时），渗透压对照（40 mM甘露醇） 阅读提示：参见Materials and Methods 2.2节 |
| siRNA转染 | siRNA浓度（50 nM），转染试剂（Lipofectamine 2000），转染时间（未明确），si-Isg15序列 阅读提示：参见Materials and Methods 2.2节和Table 1 |
| 焦亡检测 | Annexin V/PI双阳性率检测方法，LDH释放检测，IL-18 ELISA，ROS检测（DCFH-DA和MitoSOX） 阅读提示：参见Materials and Methods 2.5, 2.6, 2.8节 |
| 信号通路抑制 | Mito-TEMPO（25 µM），MCC950（2 µM），C-176（10 µM）预处理时间（1.5小时） 阅读提示：参见Materials and Methods 2.2节 |
| 线粒体功能检测 | MitoTracker浓度（1 µM），MitoSOX浓度（5 µM），JC-1染色，mtDNA拷贝数检测方法（qPCR） 阅读提示：参见Materials and Methods 2.3, 2.10节 |