体外验证FMPLA检测18S rRNA ac4C
验证FMPLA在体外对已知ac4C位点的检测能力和特异性。
从HeLa细胞提取总RNA，与ADB-探针A进行FTDR反应，然后加入探针B、C1、C2进行连接和RCA，最后用MB检测荧光。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用氟代谢标记介导的邻近连接法对N4-乙酰胞苷修饰RNA进行单细胞成像
Single-cell imaging of N4-acetylcytidine-modified RNA using fluorine metabolic labeling mediated proximity ligation assay.
实验完整度
高包含体外反应、细胞成像（多种细胞系）、药物处理及耐药细胞模型等多个实验层级，并通过对照、抑制剂和siRNA敲降进行功能验证。
主要模型
HeLa细胞 HEK293T细胞 MCF-10A细胞 K562及K562/ADR耐药细胞
重点核对
NAT10抑制剂Remodelin处理浓度及时间 siRNA敲降CA9和NAT10的转染条件 乙基氟乙酸酯代谢标记浓度和孵育时间 探针杂交距离对PLA信号的影响 细胞周期同步化实验的双胸苷阻断方案
摘要
N4-乙酰胞苷（ac4C）是一种新兴的表观转录组标记，参与调控RNA稳定性、翻译和基因表达。尽管其在基因调控和疾病中的作用日益凸显，但当前用于原位检测ac4C修饰RNA的方法缺乏灵敏度和特异性。为克服这些挑战，我们开发了氟代谢标记介导的邻近连接分析（FMPLA），该方法结合氟代谢标记和邻近连接分析，可精确检测新合成的氟代谢标记的ac4C位点。该方法能够高灵敏度地可视化多种RNA种类，并揭示细胞周期和化疗应激下ac4C修饰RNA的丰度及空间动态。此外，FMPLA还揭示了耐药癌细胞中不同的RNA修饰模式，凸显了其在研究RNA ac4C修饰功能和机制方面的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发一种灵敏且特异的原位成像方法，用于单细胞水平检测ac4C修饰的RNA，并探究其在不同细胞过程和疾病模型中的动态变化？
- 核心机制
- 氟代代谢标记形成F-ac4C，经氟-硫置换反应与探针A结合，再通过邻近连接和滚环扩增产生信号，实现特异性检测。
- 主要证据
- 体外和细胞内验证18S rRNA ac4C位点，并通过NAT10抑制剂、siRNA敲降、竞争性阻断等对照证明特异性；观察细胞周期、顺铂处理和多柔比星耐药模型中的ac4C变化。
- 研究意义
- FMPLA为研究RNA ac4C修饰的功能和机制提供了有力工具，有望促进RNA生物学研究及其在癌症等疾病模型中的应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞内FMPLA成像验证
在HeLa细胞中验证FMPLA对18S rRNA 1842-ac4C位点的原位成像能力。
对固定的HeLa细胞进行FMPLA反应，包括ADB-探针A孵育、探针B杂交、连接和RCA，最后用MB杂交并成像。
验证FMPLA特异性
通过多种对照实验和药物处理验证FMPLA对ac4C修饰的特异性。
使用Remodelin抑制NAT10，siRNA敲降CA9或NAT10，以及竞争性阻断等对照，观察荧光信号变化。
细胞周期中ac4C动态检测
探究ac4C修饰在细胞周期不同阶段的动态变化。
使用双胸苷阻断同步化HeLa细胞，在释放后不同时间点进行乙基氟乙酸酯标记，然后用FMPLA成像检测多种RNA的ac4C水平。
顺铂处理下ac4C变化检测
检测顺铂处理对HeLa细胞中多种RNA ac4C修饰水平和定位的影响。
HeLa细胞经顺铂处理后，使用FMPLA检测ASPH mRNA、VPS25、FRMD8、LINC00667、tRNA-Leu等RNA的ac4C信号。
多柔比星耐药细胞中ac4C水平检测
比较K562细胞及其耐药株K562/ADR在DOX处理前后ac4C修饰水平的差异。
K562和K562/ADR细胞经DOX处理后，使用FMPLA检测TOMM7 mRNA的ac4C信号。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| IMDM培养基 | Procell Co., Ltd. | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | Remodelin | MedChemExpress | HY-16706 |
| 顺铂 | Yeasen | -- | |
| 多柔比星 | Aladdin | A183027 | |
| 细胞培养 | MCF-10A专用培养基 | Procell Co., Ltd. | -- |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMax转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA定量 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher | -- |
| RT-qPCR | TransScript Green一步法RT-qPCR SuperMix | TransGen Biotech | -- |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Pierce | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 兔抗GAPDH抗体 | Proteintech | -- | |
| 兔抗NAT10抗体 | Proteintech | -- | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG (H+L) | Proteintech | -- | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Rhea ECL化学发光底物 | US Everbright, Inc. | -- | |
| 探针制备 | DBCO标记的探针A | -- | -- |
| 探针纯化 | Oligo Clean & Concentrator试剂盒 | Zymo Research | D4061 |
| 体外反应 | T4 DNA连接酶 | -- | -- |
| RiboLock RNA酶抑制剂 | -- | -- | |
| 三(2-羧乙基)膦 | -- | -- | |
| phi29 DNA聚合酶 | -- | -- | |
| 分子信标 | -- | -- | |
| 单分子FISH | Cy5标记的DNA探针 | -- | -- |
| 细胞染色 | DAPI | -- | -- |
| 原位成像 | Leica TCS SP8 DIVE共聚焦显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基类型、血清浓度、培养条件。 阅读提示：Methods: Cell culture and treatments |
| 代谢标记 | 乙基氟乙酸酯浓度（2 mM）、孵育时间（8-12小时）。 阅读提示：Methods: Cell culture and treatments |
| FMPLA反应 | 探针浓度（ADB-Probe A 400 nM, Probe B 100 nM, C1/C2 100 nM）、反应时间（各12小时、3小时等）、缓冲液成分。 阅读提示：Methods: In situ imaging of ac4C RNA with FMPLA |
| RCA反应 | phi29 DNA聚合酶浓度（1 U/μl）、反应时间（16小时）、温度（37°C）。 阅读提示：Methods: In situ RCA reaction |
| 药物处理 | Remodelin浓度（50 μM）、处理时间（16小时）；顺铂浓度（0.5 μM）、处理时间（16小时）；DOX浓度（1 μg/ml）、处理时间（24小时）。 阅读提示：Methods: Cell culture and treatments |
| 细胞周期同步化 | 胸苷浓度（2 mM）、处理时间（18小时）、释放时间（9小时）、乙基氟乙酸酯标记时间（2或8小时）。 阅读提示：Methods: Cell culture and treatments |