构建和制备重组VSV-CHIKV
获得重组的VSV-CHIKV病毒用于后续实验。
基于先前报告构建rVSV-CHIKV-EGFP，将CHIKV的E3-E2-6K-E1基因替换VSV的G蛋白基因，通过共转染BHK-21细胞产生病毒，并进行扩增、纯化和滴定。
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VSV-CHIKV通过诱导黑色素瘤模型中的细胞焦亡激活抗肿瘤免疫
VSV-CHIKV activates antitumor immunity by inducing pyroptosis in a melanoma model.
实验完整度
高包含体外细胞实验（B16、MC38细胞系）、动物模型（B16异种移植小鼠）、分子机制验证（GSDMD抑制剂LDC7559）及联合治疗实验，多层次验证功能与机制。
主要模型
B16小鼠黑色素瘤细胞系 B16异种移植C57BL/6小鼠模型 MC38结肠癌细胞系（补充验证）
重点核对
VSV-CHIKV感染B16细胞的MOI=1，处理24小时 GSDMD抑制剂LDC7559的体外使用浓度10μM，体内剂量10mg/kg B16细胞皮下接种数量3×10^6，治疗起始时间肿瘤接种后12天 瘤内注射VSV-CHIKV剂量1×10^6 PFU/10μL，每两天一次共五次 抗PD-1抗体（BioXCell，BE0146）剂量5mg/kg，腹腔注射隔天一次共五次
摘要
黑色素瘤因其治疗困难、高复发率和转移能力而成为最危险的皮肤癌。作为溶瘤病毒（OVs）的载体，水疱性口炎病毒（VSV）已被证明对恶性黑色素瘤有效。然而，VSV的糖蛋白G蛋白具有潜在的神经毒性。已有研究表明，用基孔肯雅病毒（CHIKV）的E3-E2-6K-E1替换糖蛋白G可降低其神经毒性并靶向胶质瘤。因此，本研究旨在探讨重组VSV-CHIKV对黑色素瘤的溶瘤作用及其潜在机制。在本研究中，我们发现重组VSV-CHIKV触发GSDMD介导的黑色素瘤细胞焦亡。重要的是，在黑色素瘤细胞系和异种移植小鼠模型中，VSV-CHIKV感染后NLRP3/Caspase-1/GSDMD轴被激活。抑制GSDMD阻断了细胞焦亡、抗肿瘤免疫和肿瘤对VSV-CHIKV治疗的反应，表明VSV-CHIKV通过GSDMD通路发挥作用。VSV-CHIKV触发的GSDMD介导的肿瘤焦亡招募细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）进入肿瘤微环境，并伴随炎症介质的释放。这重塑了肿瘤微环境，将免疫学上“冷”的肿瘤转变为“热”的肿瘤，从而使这些肿瘤对检查点阻断敏感。最后，VSV-CHIKV与免疫检查点抑制剂（抗PD-1）的联合治疗延长了小鼠的生存期。总之，VSV-CHIKV策略是对抗黑色素瘤的一种有吸引力的生物疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 重组VSV-CHIKV是否对黑色素瘤有效，其诱导细胞焦亡的潜在作用及机制是什么？
- 核心机制
- VSV-CHIKV通过激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD轴诱导黑色素瘤细胞焦亡，GSDMD介导的焦亡招募CTL进入肿瘤微环境，重塑微环境，将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤，从而增强对PD-1阻断的敏感性。
- 主要证据
- 体外实验显示VSV-CHIKV感染B16细胞诱导焦亡标志（LDH释放、PI摄取、IL-1β/IL-18升高、GSDMD-N表达）；动物模型中VSV-CHIKV抑制肿瘤生长并激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD；GSDMD抑制剂LDC7559逆转这些效应；联合抗PD-1延长小鼠生存期。
- 研究意义
- VSV-CHIKV作为一种有吸引力的黑色素瘤生物疗法，无论是作为单一疗法还是与免疫检查点抑制剂联合使用，都具有潜在应用价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外检测VSV-CHIKV对黑色素瘤细胞的杀伤作用
验证VSV-CHIKV是否能诱导黑色素瘤细胞死亡并鉴定细胞死亡类型。
用VSV-CHIKV（MOI=1）感染B16细胞24小时，观察细胞形态变化，检测LDH释放、PI摄取、IL-1β/IL-18分泌及NLRP3/Caspase-1/GSDMD蛋白表达。
验证NLRP3/Caspase-1/GSDMD轴的作用
确定VSV-CHIKV诱导的焦亡是否依赖NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路。
使用GSDMD抑制剂LDC7559（10μM）处理VSV-CHIKV感染的B16细胞，检测焦亡指标（细胞形态、LDH、PI、IL-1β/IL-18、GSDMD-N表达）的变化。
体内验证VSV-CHIKV的抗肿瘤效应
评估VSV-CHIKV在黑色素瘤小鼠模型中的肿瘤抑制作用。
在C57BL/6小鼠皮下接种B16细胞，待肿瘤形成后瘤内注射VSV-CHIKV（1×10^6 PFU，五次），测量肿瘤体积和重量，检测肿瘤组织中焦亡相关蛋白和细胞因子水平，并通过HE染色检测主要器官毒性。
验证GSDMD抑制对肿瘤抑制和免疫的影响
确定GSDMD在VSV-CHIKV诱导的肿瘤抑制和抗肿瘤免疫中的必要性。
在动物模型中，将LDC7559（10mg/kg）与VSV-CHIKV联合瘤内注射，比较肿瘤生长、细胞因子水平、GSDMD-N表达及免疫细胞浸润的变化。
检测抗肿瘤免疫应答
评估VSV-CHIKV治疗后肿瘤微环境中的免疫激活状态。
通过RT-qPCR检测肿瘤组织中IFN-γ、IL-2、IL-12、TGF-β、Foxp3的mRNA表达，并通过流式细胞术检测CD3+CD8+ T细胞浸润及PD-1/PD-L1表达。
联合抗PD-1治疗的生存评估
评估VSV-CHIKV与抗PD-1联合治疗对黑色素瘤小鼠生存期的影响。
B16荷瘤小鼠先瘤内注射VSV-CHIKV（1×10^6 PFU），随后腹腔注射抗PD-1（5mg/kg）或IgG，共五次，记录生存曲线。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | CORNING | -- |
| 胎牛血清 | Cell-Box | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Cytiva | -- | |
| 高糖DMEM | Procell | -- | |
| 病毒构建 | LDC7559 | MedChemExpress | -- |
| ELISA检测 | IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒 | Servicebio | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | NCM Biotech | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | NCM Biotech | -- | |
| 抗NLRP3抗体 | Proteintech | 68102-1-Ig | |
| 免疫组化 | 抗Caspase-1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-56036 |
| 抗剪切Caspase-1抗体 | Affinity | AF4022 | |
| 抗GSDMD抗体 | Abcam | ab219800 | |
| 抗GSDMD-N抗体 | Affinity | DF13758 | |
| Western blot | 抗β-微管蛋白抗体 | Affinity | AF7011 |
| HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Proteintech | SA00001-2 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L） | Proteintech | SA00001-1 | |
| SuperSignal West Pico化学发光底物试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | PE标记的抗CD4抗体 | Biolegend | 100408 |
| APC标记的抗CD8抗体 | Biolegend | 100765 | |
| FITC标记的抗CD3抗体 | Biolegend | 100306 | |
| APC大鼠IgG2a同型对照 | Elabscience | E-AB-F09832E | |
| APC抗小鼠CD279/PD-1抗体 | Elabscience | E-AB-F1131E | |
| APC大鼠IgG2b同型对照 | Elabscience | E-AB-F09842E | |
| APC抗小鼠CD274/PD-L1抗体 | Elabscience | E-AB-F1132E | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 动物实验 | 抗小鼠PD-1抗体 | BioXCell | BE0146 |
| I型胶原酶 | Worthington | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | B16细胞系购自Procell（CL-0029），培养于高糖DMEM（10%FBS，1%青霉素-链霉素），37°C，5% CO2。 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| 病毒构建与制备 | rVSV-CHIKV-EGFP构建参考先前报道（doi: 10.1038/s41541-024-00814-2），病毒繁殖使用BHK-21细胞。 阅读提示：Materials and methods, VSV-CHIKV construction, propagation, purification and observation |
| 体外焦亡实验 | B16细胞2×10^5接种于6孔板，VSV-CHIKV MOI=1处理24h；LDC7559浓度10 μM，溶剂10% DMSO/90%玉米油。 阅读提示：Materials and methods, Cell pyroptosis analysis |
| 动物模型 | C57BL/6雄性小鼠（6周龄，20-22g），皮下接种3×10^6 B16细胞，肿瘤接种后12天开始治疗，瘤内注射VSV-CHIKV 1×10^6 PFU/10μL，每两天一次共5次；LDC7559剂量10mg/kg；抗PD-1剂量5mg/kg。 阅读提示：Materials and methods, Animal tests |
| 免疫检测 | RT-qPCR检测IFN-γ、IL-2、IL-12、TGF-β、Foxp3；流式检测CD3+CD8+ T细胞及PD-1/PD-L1表达。 阅读提示：Materials and methods, RT-qPCR analysis, Flow cytometry; Results, Inhibition of GSDMD impairs VSV-CHIKV-induced antitumor immunity |