数据获取与处理
获取胃癌转录组数据并筛选铁死亡相关lncRNA。
从TCGA下载375例胃癌和32例正常样本数据，去除低表达基因后获得930个lncRNA；从FerrDb V1获取259个铁死亡相关基因，通过Pearson相关分析筛选出741个铁死亡相关lncRNA。
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胃癌中铁死亡相关长链非编码RNA的综合分析及其与肿瘤进展和铁死亡的关系
Comprehensive analysis of ferroptosis-related long non-coding RNA and its association with tumor progression and ferroptosis in gastric cancer.
实验完整度
高结合TCGA数据构建预后模型，并用临床样本及细胞功能实验验证，涉及细胞增殖、迁移、凋亡和铁死亡检测。
主要模型
TCGA胃癌队列（375例肿瘤样本，32例正常样本） 人胃癌细胞系（SNU-1、NCI-N87、AGS、HGC-27） 人正常胃上皮细胞系GES-1 配对胃癌及癌旁组织（n=27）
重点核对
8个铁死亡相关lncRNAs（AL365181.3、MIR3142HG、PVT1、LINC01315、AL353804.1、HAGLR、AC005586.1、AC245041.1）的表达与风险评分 HAGLR在胃癌组织和细胞系中的表达水平（AGS和HGC-27细胞中显著上调） HAGLR敲低效率（使用shHAGLR-1/2/3，选择shHAGLR-2和shHAGLR-3进行功能实验） 铁死亡诱导剂erastin处理浓度（10μM）及检测指标（ROS、MDA、Fe2+、GSH、ACSL4、GPX4） 细胞增殖、迁移、凋亡检测的时间点（CCK-8：24、48、72、96小时；划痕实验：0和24小时；Transwell：48小时）
摘要
胃癌(GC)是最常见的恶性肿瘤之一，预后不良。铁死亡是一种独特的非凋亡性细胞死亡类型，与肿瘤预后密切相关。因此，我们旨在基于铁死亡相关的lncRNA开发一种新的预后风险模型，并挖掘新的诊断标志物。在本研究中，基于TCGA数据库，共获得8个铁死亡相关的lncRNA用于构建GC预后模型。高危组患者的生存率低于低危组，且风险分组可作为OS的独立预后因素。受试者工作特征曲线分析表明，该风险模型在预测GC预后方面优于传统的临床病理特征。GSEA显示，这些lncRNA主要参与细胞粘附、癌症通路和免疫功能调节。该风险特征的关键基因HAGLR在GC组织和细胞中上调。功能实验表明，敲低HAGLR可有效抑制GC细胞增殖和迁移，而沉默HAGLR加速了细胞凋亡和铁死亡过程。总之，我们建立了一个包含8个lncRNA的新型铁死亡相关预后风险特征，这可能提高GC患者预后预测的准确性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 筛选与胃癌预后相关的铁死亡相关lncRNA，并探讨其生物学功能，特别是关键基因HAGLR在胃癌进展和铁死亡中的作用。
- 核心机制
- HAGLR通过抑制铁死亡和细胞凋亡，促进胃癌细胞增殖和迁移，从而影响患者预后。
- 主要证据
- 基于TCGA数据构建的预后模型显示HAGLR高表达与不良生存相关；细胞实验表明敲低HAGLR抑制增殖迁移，促进凋亡，增加ROS、MDA和Fe2+水平，降低GSH，并诱导线粒体形态变化及ACSL4上调、GPX4下调。
- 研究意义
- 该预后模型可能提高胃癌患者预后预测的准确性，HAGLR可能成为胃癌治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建预后模型
筛选与胃癌患者总生存期相关的铁死亡lncRNAs，并构建风险评分模型。
通过单因素Cox回归和Kaplan-Meier分析筛选16个预后相关lncRNAs，进一步多因素Cox回归基于AIC最小准则筛选8个lncRNAs构建模型。计算每位患者的风险评分，并根据中位数分为高低风险组。
预后模型验证
验证风险模型在预测胃癌患者生存中的准确性和独立性。
在训练集和验证集中进行Kaplan-Meier分析、时间依赖ROC曲线、单因素和多因素Cox回归以及多指标ROC曲线分析，评估模型的预测性能。并通过分层分析检验模型在不同临床亚组中的适用性。
构建并评估列线图
建立结合风险评分和临床因素的列线图，以预测个体患者的1年和3年生存概率。
基于风险评分、年龄、性别、分级和临床分期构建列线图，并通过校准曲线、多指标ROC曲线和决策曲线分析评估其预测准确性和实用性。
功能富集分析
探索风险模型相关的生物学通路和功能。
使用GSEA对高低风险组间的差异通路进行分析，基于差异表达基因（DEGs）进行GO富集分析。
免疫浸润分析
评估高低风险组间免疫细胞浸润和免疫相关通路的差异。
利用ssGSEA计算16种免疫细胞和13种免疫功能的富集分数，并比较两组间的差异。
组织及细胞中lncRNA表达验证
验证模型中的八个lncRNAs在胃癌组织和细胞系中的表达差异。
通过RT-qPCR检测27对胃癌及癌旁组织中八个lncRNAs的表达，并在TCGA数据集中验证关键基因HAGLR的表达，同时检测胃癌细胞系中HAGLR的表达水平。
细胞功能实验
验证HAGLR对胃癌细胞增殖、迁移、凋亡和铁死亡的影响。
使用shRNA敲低HAGLR后，通过CCK-8、集落形成、划痕、Transwell实验检测增殖和迁移；通过流式细胞术检测凋亡；通过检测ROS、MDA、Fe2+、GSH水平和透射电镜观察线粒体形态，以及Western blot检测ACSL4和GPX4蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | solaibio | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipo3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | EasyScript一步法去基因组DNA和cDNA合成预混液 | TransGen Biotech | -- |
| TB Green Premix ExTaq II | TaKaRa | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗ACSL4抗体 | proteintech | 22401-1-AP | |
| 抗GPX4抗体 | proteintech | 30388-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab32572 | |
| 增强化学发光试剂 | US Everbright, Inc. | -- | |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂 | -- | -- |
| 细胞凋亡 | FITC-Annexin V/PI凋亡检测试剂盒 | US Everbright Inc. | F6012 |
| 细胞迁移 | Transwell小室 | JET BIOFIL | TCS013024 |
| ROS检测 | DHE染色 | Beyotime | -- |
| 铁离子检测 | 亚铁离子比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K773-M |
| MDA检测 | 丙二醛比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K028-M |
| GSH检测 | 谷胱甘肽比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K030-M |
| 蛋白定量 | BCA蛋白比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K318-M |
| 显微镜观察 | 透射电子显微镜 | -- | -- |
| 流式分析 | FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| BD CellQuest Pro软件1.2版 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 预后模型构建 | TCGA数据中胃癌样本数量（375例肿瘤、32例正常），排除标准（平均表达<0.5，随访<30天），纳入患者数（334例），验证集随机划分（167例）。 阅读提示：Materials and methods: Data acquisition and processing; 图1B 流程图 |
| 铁死亡相关lncRNA筛选 | Pearson相关系数阈值：|correlation coefficient|>0.3，p<0.001；选择的Ferrdb V1数据库中基因数量（259）。 阅读提示：Materials and methods: Screening ferroptosis-related LncRNA in GC |
| 预后模型建立 | 8个lncRNAs的系数和表达式，风险评分公式，中位风险评分（1.1064）用于分组。 阅读提示：Materials and methods: Establishment and identification of a ferroptosis-related LncRNA prognostic model; 结果部分 |
| 细胞培养与转染 | 细胞系（AGS和HGC-27）、shRNA序列（shHAGLR-1/-2/-3和shCtrl）、转染试剂（Lipo3000）、转染时间（48小时）。 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and cell transfection |
| 铁死亡相关检测 | erastin浓度（10μM）、DHE染色浓度（5μM）及孵育时间（30分钟）、MDA/GSH/Fe2+检测方法、线粒体形态观察（TEM）条件。 阅读提示：Materials and methods: ROS measurements; MDA, GSH and Fe2+ assays; Mitochondrial transmission electron microscopy observation |