假病毒感染性检测
评估不同SARS-CoV-2变体刺突蛋白介导的病毒感染能力。
使用VSV假病毒系统包装表达11种变体刺突蛋白的假病毒，感染多种靶细胞，24小时后检测荧光素酶活性以评估感染效率。
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SARS-CoV-2 JN.1变异株的免疫逃逸、感染性和膜融合特性
Immune evasion, infectivity, and membrane fusion of the SARS-CoV-2 JN.1 variant.
实验完整度
高包含假病毒和活病毒体外感染实验、跨物种ACE2感染实验、受体结合实验、细胞融合实验、抑制剂实验及中和抗体实验等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
293T-ACE2细胞 293T-ACE2-TMPRSS2细胞 Calu-3细胞 VSV假病毒系统
重点核对
假病毒感染实验使用293T-ACE2、293T-ACE2-TMPRSS2等细胞，感染后24小时检测荧光素酶活性。 活病毒感染实验使用293T-ACE2、293T-ACE2-TMPRSS2和Calu-3细胞，感染剂量为500 TCID50，感染2小时后更换培养基。 中和实验使用50%组织培养感染剂量（TCID50）为1000的假病毒，血清初始稀释度为1:20，5倍系列稀释，孵育1小时后感染293T-ACE2细胞。 细胞融合实验使用T7聚合酶报告系统，供体细胞和受体细胞以2:1比例混合，共培养12至16小时。 抑制剂实验使用293T-ACE2或293T-ACE2-TMPRSS2细胞，预处理2小时，E64d浓度为5μM，Camostat浓度为50μM。
摘要
SARS-CoV-2在传播过程中持续突变，产生了多种奥密克戎亚变体。目前，SARS-CoV-2 BA.2.86及其后代JN.1、KP.2、KP.1.1已被确定为全球传播的主要变体。这些新出现的奥密克戎变体传播性增强，可能增加人群病毒再感染的风险。然而，新出现的奥密克戎亚变体在感染宿主细胞方面的生物学特性仍不清楚。在本研究中，我们评估了BA.2.86及其后代JN.1，以及D614G、BA.2、BA.4/5、XBB.1.5、EG.5.1、HV.1、HK.3、JD.1.1和JG.3对来自BA.5或XBB.1.5株感染个体的恢复期血清的中和效果。我们通过测量病毒感染性、受体亲和力和膜融合来评估变体刺突蛋白的生物学特性。与XBB相关亚变体相比，BA.2.86表现出较低的免疫逃逸反应，但JN.1表现出显著增强的免疫逃逸能力，这与其快速传播密切相关。BA.2.86在易感细胞中的感染性较低，而JN.1变体表现出相对较高的感染性。值得注意的是，BA.2.86和JN.1在293T-ACE2细胞中表现出低融合活性，但在跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）过表达细胞中表现出较高的膜融合能力。本研究探讨了新出现的奥密克戎亚变体在宿主适应中的进化特征，并为2019冠状病毒病（COVID-19）的预防和治疗提供了新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 新出现的奥密克戎亚变体BA.2.86和JN.1在宿主细胞感染、受体结合、膜融合、病毒进入途径和免疫逃逸方面的生物学特性如何？
- 核心机制
- JN.1的L455S突变增强了刺突蛋白的蛋白酶裂解效率和膜融合能力，使其更倾向于通过TMPRSS2依赖的膜融合途径进入细胞，从而增强病毒感染性；同时，L455S突变导致抗体识别逃逸，增强免疫逃逸能力。
- 主要证据
- 通过假病毒感染实验和活病毒感染实验证明JN.1比BA.2.86具有更高的感染性；流式细胞术显示JN.1刺突蛋白与ACE2结合亲和力略低于BA.2.86；细胞-细胞融合实验表明JN.1在TMPRSS2过表达细胞中融合活性增强；抑制剂实验显示JN.1更依赖TMPRSS2进入细胞；中和实验显示JN.1对BA.5和XBB.1.5突破感染血清的抵抗力显著高于BA.2.86。
- 研究意义
- 研究结果强调需要开发针对JN.1亚系和其他新兴变体的疫苗，并密切监测其传播，以对抗COVID-19大流行。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
跨物种ACE2感染性检测
评估新奥密克戎变体对不同物种ACE2的感染能力，以估计跨物种传播潜力。
将表达不同物种ACE2的质粒转染至293T细胞，感染假病毒，24小时后检测感染效率。
活病毒感染实验
在BSL-3设施中验证JN.1、EG.5.1和HK.3活病毒进入、复制和释放的效率。
将JN.1、EG.5.1和HK.3活病毒以500 TCID50感染293T-ACE2、293T-ACE2-TMPRSS2和Calu-3细胞，在感染后2、24、48小时收集上清和细胞裂解物，提取RNA并定量病毒RNA拷贝数。
受体结合亲和力检测
评估变体刺突蛋白与可溶性人ACE2的结合亲和力。
将表达变体刺突蛋白的质粒转染至293T细胞，36小时后与可溶性重组人ACE2-hFc融合蛋白孵育，然后与PE标记的二抗孵育，通过流式细胞术检测平均荧光强度（MFI），并以刺突蛋白表面表达量进行标准化。
融合活性检测
评估变体刺突蛋白介导的细胞-细胞融合能力。
使用T7聚合酶报告系统，供体细胞（293T）转染变体刺突蛋白、T7启动子-IRES-Luc2和pRL-TK，受体细胞（293T-ACE2或293T-ACE2-TMPRSS2）转染T7聚合酶-T2A-EGFP。转染36小时后混合供体和受体细胞，共培养12-16小时，检测荧光素酶活性并观察合胞体。
病毒进入途径抑制实验
评估新奥密克戎变体对TMPRSS2和蛋白酶体抑制剂的敏感性，以确定病毒进入途径。
在293T-ACE2或293T-ACE2-TMPRSS2细胞中，分别用E64d（组织蛋白酶抑制剂）、Camostat（TMPRSS2抑制剂）、氯喹和阿比朵尔处理，然后感染变体假病毒，24小时后检测感染效率。
免疫逃逸检测
评估不同变体对来自疫苗接种者和突破感染康复者血清的中和敏感性。
将血清进行5倍系列稀释（初始稀释度1:20），与1000 TCID50的假病毒孵育1小时，然后感染293T-ACE2细胞，24小时后检测荧光素酶活性，计算ID50值。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 假病毒包装 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 假病毒感染检测 | 被动裂解缓冲液 | Promega | -- |
| 荧光素酶底物 | Promega | -- | |
| SpectraMax L酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 活病毒感染实验 | QIAamp病毒RNA小提试剂盒 | QIAGEN | -- |
| Super FastPure细胞RNA提取试剂盒 | Vazyme | -- | |
| SARS-CoV-2核酸检测试剂盒 | Liferiver | -- | |
| 流式分析 | 小鼠抗SARS-CoV-2刺突抗体 | Genetex | -- |
| 可溶性重组人ACE2-hFc融合蛋白 | Sino Biological | -- | |
| PE标记的抗小鼠IgG | Biolegend | -- | |
| PE标记的抗人IgG Fc | Biolegend | -- | |
| Accuri C6流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞融合实验 | 双荧光素酶报告基因检测 | Promega | -- |
| 抑制剂实验 | Camostat | -- | -- |
| E64d | -- | -- | |
| 氯喹 | -- | -- | |
| Apilimod | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 假病毒感染性检测 | 靶细胞类型、细胞密度、感染时间、假病毒用量、阳性对照与阴性对照设置。 阅读提示：Methods中'Pseudovirus infection assay'部分，以及图1图例。 |
| 跨物种ACE2感染性检测 | 不同物种ACE2质粒、转染效率、感染时间、对照设置。 阅读提示：Methods中'Pseudovirus infection assay'部分，以及图2图例。 |
| 活病毒感染实验 | 活病毒株、细胞类型、感染剂量、孵育时间、取样时间点、RNA提取和定量方法。 阅读提示：Methods中'SARS-CoV-2 live virus infection assay'部分，以及图3图例。 |
| 受体结合亲和力检测 | 刺突蛋白表达质粒、转染时间、抗体浓度、检测仪器。 阅读提示：Methods中'Flow cytometric analysis of ACE2 binding'部分，以及图4图例。 |
| 融合活性检测 | 供体/受体细胞密度、比例、共培养时间、检测系统。 阅读提示：Methods中'Cell–cell fusion assay'部分，以及图5图例。 |
| 病毒进入途径抑制实验 | 抑制剂种类、浓度、预处理时间、感染时间。 阅读提示：Methods中'Effect of endocytosis or protease inhibitors on Omicron variants pseudovirus infection'部分，以及图6图例。 |
| 免疫逃逸检测 | 血清样本来源、稀释系列、假病毒量、孵育条件、检测时间。 阅读提示：Methods中'Pseudovirus neutralization assay'部分，以及图7图例。 |