建立舒尼替尼耐药细胞模型（SU-R）
获得对舒尼替尼耐药的细胞系
将亲本RCC细胞用逐渐增加浓度的舒尼替尼处理16周，最终在10 µM浓度下维持培养，建立SU-R细胞系。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CYP1B1通过USP5介导的HIF2α去泛素化促进透明细胞肾细胞癌的血管生成和舒尼替尼耐药
CYP1B1 promotes angiogenesis and sunitinib resistance in clear cell renal cell carcinoma via USP5-mediated HIF2α deubiquitination.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内异种移植模型、临床样本及多组学分析，并有功能验证和机制验证。
主要模型
786O细胞系 OSRC2细胞系 ACHN细胞系 HUVEC细胞系 患者来源异种移植模型 细胞系来源异种移植模型 原位异种移植模型 临床肾癌组织样本
重点核对
CYP1B1在舒尼替尼耐药细胞和临床标本中的表达上调 VHL调控CYP1B1稳定性及泛素化 CYP1B1调控HIF2α蛋白稳定性及泛素化 USP5与CYP1B1和HIF2α的相互作用 PCD-1对舒尼替尼耐药细胞增殖和血管生成的抑制作用
摘要
透明细胞肾细胞癌（ccRCC）与von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因突变有很强的病因学关联，该突变导致缺氧诱导因子的组成性激活和病理性血管生成。尽管越来越多的证据表明靶向VEGF信号传导的抗血管生成治疗可以延长ccRCC患者的生存期，但对舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂的治疗耐药性的频繁出现仍然是关键的临床局限。通过对舒尼替尼耐药细胞模型、患者来源的异种移植瘤和临床标本的综合多组学分析，我们系统地确定了CYP1B1是治疗耐药的核心介质。转录组和基因组分析显示，耐药肿瘤中CYP1B1的过表达在功能上有助于增强血管生成潜力并维持耐药表型。机制研究表明，CYP1B1通过促进USP5介导的去泛素化来稳定缺氧诱导因子2α（HIF2α），从而防止蛋白酶体降解。值得注意的是，我们确定VHL是一种新的E3泛素连接酶，可调节CYP1B1的周转；值得注意的是，ccRCC中的VHL缺陷通过抑制泛素化促进CYP1B1蛋白积累。这些发现建立了一个前馈调节轴，其中VHL缺失诱导的CYP1B1稳定化促进HIF2α信号持续，最终驱动舒尼替尼耐药。我们的研究描绘了CYP1B1-USP5-HIF2α信号级联作为关键的耐药机制，从而揭示了难治性ccRCC中一个可靶向的弱点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CYP1B1在ccRCC舒尼替尼耐药中的功能和机制是什么？
- 核心机制
- CYP1B1通过USP5介导HIF2α去泛素化，稳定HIF2α蛋白，增强HIF2α/VEGFA信号，促进血管生成和舒尼替尼耐药；VHL缺乏通过抑制CYP1B1泛素化导致CYP1B1积累。
- 主要证据
- 多组学分析、细胞功能实验、体内异种移植模型、Co-IP和GST pull-down实验证明了CYP1B1-USP5-HIF2α轴。
- 研究意义
- CYP1B1可作为克服TKI耐药的治疗靶点，联合抑制CYP1B1可能协同减弱舒尼替尼耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定与舒尼替尼耐药相关的关键基因
找到驱动舒尼替尼耐药的关键分子
通过RNA-seq对CDX模型进行转录组分析，比较耐药和敏感肿瘤的差异表达基因，并进行功能富集分析，发现血管生成相关通路富集。进一步整合PDX（GSE76068）和临床样本（E-MTAB-3267）数据，筛选出CYP1B1。
验证CYP1B1在耐药组织中的表达
确认CYP1B1在耐药情况下的表达变化
通过IHC检测患者原发和耐药肿瘤组织中的CYP1B1蛋白水平；在TCGA和E-MTAB-3267队列中分析CYP1B1表达与生存期和临床病理特征的相关性；在细胞水平用RT-qPCR和western blot检测舒尼替尼诱导过程中的CYP1B1表达变化。
研究VHL对CYP1B1的调控
探究VHL是否通过泛素化调节CYP1B1稳定性
通过VHL敲低或过表达检测CYP1B1蛋白和mRNA水平；用Co-IP和GST pull-down检测VHL与CYP1B1的相互作用；用CHX追踪蛋白半衰期；用MG132和CQ处理检测降解途径；检测CYP1B1的泛素化水平。
验证CYP1B1对舒尼替尼敏感性的影响
评估CYP1B1对ccRCC细胞舒尼替尼敏感性的功能影响
在WT和SU-R细胞中过表达或敲低CYP1B1，通过CCK-8、EdU、Transwell和western blot检测细胞活力、增殖、迁移及EMT标志物表达；建立异种移植模型，在体内验证CYP1B1敲低对舒尼替尼敏感性的影响。
评估CYP1B1对血管生成的影响
验证CYP1B1是否促进血管生成及血管生成拟态
使用CYP1B1降解剂PCD-1处理，进行HUVEC管形成实验、Matrigel plug实验和CAM实验，检测血管生成；用RT-qPCR和western blot检测HIF2α/VEGFA信号通路相关基因表达。
阐明CYP1B1调控HIF2α稳定性的机制
探究CYP1B1如何稳定HIF2α蛋白
通过Co-IP、GST pull-down和免疫荧光确定CYP1B1与HIF2α的相互作用和共定位；用CHX和抑制剂处理检测HIF2α的半衰期和降解途径；检测HIF2α的泛素化水平；筛选并验证去泛素化酶，确定USP5是关键的相互作用蛋白。
验证USP5在CYP1B1介导的HIF2α稳定化中的作用
确认USP5去泛素化酶活性是CYP1B1稳定HIF2α所必需的
在CYP1B1敲低或过表达的细胞中，转染野生型或催化失活型USP5（C335A），检测HIF2α蛋白水平和泛素化水平变化。
评估CYP1B1抑制剂的治疗效果
验证抑制CYP1B1能否克服舒尼替尼耐药
用PCD-1处理WT和SU-R细胞，检测细胞活力、增殖、凋亡和HIF2α/VEGFA蛋白表达；建立原位异种移植模型，比较PCD-1和舒尼替尼单独及联合治疗的效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | Boster | -- | |
| 耐药细胞建立 | 舒尼替尼 | Selleck Chemicals | -- |
| 基因敲低 | 短发夹RNA | Genomeditech | -- |
| 基因过表达 | Flag标签质粒 | Genomeditech | -- |
| GST标签质粒 | Tsingke Biotechnology | -- | |
| HA标签CYP1B1质粒 | Tsingke Biotechnology | -- | |
| His标签VHL质粒 | Tsingke Biotechnology | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Yeasen Biotechnology | -- |
| 增殖检测 | EdU试剂盒 | RiboBio | -- |
| 荧光显微镜 | 奥林巴斯IX71荧光显微镜 | Olympus | -- |
| 血管生成实验 | 基质胶 | ABW | -- |
| 药物处理 | PCD-1（CYP1B1降解剂） | MedChemExpress | -- |
| 血管生成实验 | 钙黄绿素-AM | Beyotime | -- |
| 凋亡检测 | 膜联蛋白V | Yeasen Biotechnology | -- |
| 碘化丙啶 | Yeasen Biotechnology | -- | |
| 流式细胞术 | CytoFlex流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 流式分析 | FlowJo V10软件 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Servicebio Technology | -- |
| RT-qPCR | Hifair II第一链cDNA合成试剂盒 | Yeasen Biotechnology | -- |
| SYBR Green预混液 | -- | -- | |
| StepOne PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂 | Boster | -- |
| 磷酸酶抑制剂 | Boster | -- | |
| Co-IP | 蛋白质相互作用pull-down试剂盒 | Biolinkedin | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Solarbio | -- |
| 山羊血清 | ZSGB-Bio | -- | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚） | -- | -- | |
| 共聚焦显微镜LSM880 | Zeiss | -- | |
| 动物实验 | 无胸腺裸鼠 | SIPEIFU Biotechnology | -- |
| 贝伐珠单抗 | -- | -- | |
| 抑制血管生成实验 | PCD-1（CYP1B1降解剂） | MedChemExpress | -- |
| CAM实验 | 体视显微镜Leica M165 C | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 耐药细胞模型建立 | 舒尼替尼浓度梯度、处理时长、维持浓度 阅读提示：Materials and methods, Cell lines and tissue samples |
| VHL调控CYP1B1实验 | VHL敲低或过表达所用细胞系、CHX浓度、MG132和CQ浓度及处理时间 阅读提示：Results 2, 图2 |
| CYP1B1对舒尼替尼敏感性实验 | CYP1B1过表达或敲低细胞系、舒尼替尼浓度、处理时间、动物模型及给药方案 阅读提示：Results 3, 图3 |
| 血管生成实验 | PCD-1浓度、HUVEC细胞密度、Matrigel用量、CAM实验条件 阅读提示：Results 4, 图4 |
| HIF2α稳定性实验 | CHX浓度、MG132和CQ浓度及处理时间、Co-IP抗体 阅读提示：Results 5, 图5 |
| USP5功能验证实验 | USP5野生型和突变体表达、CYP1B1敲低或过表达条件、HIF2α泛素化检测 阅读提示：Results 6, 图6 |
| 体内药效实验 | PCD-1和舒尼替尼剂量、给药方式、治疗周期、肿瘤接种细胞数和部位 阅读提示：Results 7, 图7 |