体内血管形态观察
评估Tp0136蛋白对梅毒兔皮肤病变中血管内皮细胞形态和细胞间连接的影响
在梅毒兔模型皮肤病变中，于感染后第18天（溃疡高峰期）接种Tp0136重组蛋白（记为Tp0136-day 0），每三天接种一次，PBS为对照。在第36天（Tp0136-day 18）和第42天（Tp0136-day 24）收集病变，用扫描电镜观察血管内皮细胞形态和细胞间连接。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
梅毒螺旋体蛋白Tp0136诱导血管内皮细胞球形化，导致细胞间连接增宽和血管通透性增强
Treponema pallidum Protein Tp0136 Induces Spheroidization of Vascular Endothelial Cells, Resulting in Widened Intercellular Junctions and Enhanced Vascular Permeability.
实验完整度
高研究包含体内兔梅毒模型、体外3D微流体血管模型、高通量RNA-seq、shRNA敲低、剪接抑制剂处理、RIP、qPCR、Western blot和免疫荧光等多层级验证。
主要模型
HMEC-1细胞系 梅毒兔皮肤病变模型 3D微流体血管生成系统
重点核对
兔梅毒模型中Tp0136蛋白接种剂量为10 μg，每3天接种一次，对照为PBS HMEC-1细胞在3D微流体系统中培养4天形成稳定单层后，用Tp0136蛋白处理6小时 CSRP1敲低使用CSRP1特异性shRNA，嘌呤霉素筛选4天 剪接抑制剂SSA使用浓度为100 ng/mL，处理6小时 血管通透性使用150 kDa TRITC-葡聚糖检测
摘要
梅毒螺旋体膜蛋白Tp0136促进梅毒螺旋体的播散，而血管通透性与血管内皮屏障的密度密切相关，后者又与血管内皮细胞的形态密切相关。在本研究中，采用将Tp0136重组蛋白接种到感染梅毒螺旋体的兔皮肤病变中的方法，观察到Tp0136重组蛋白诱导血管内皮细胞球形化和细胞间连接增宽。通过高通量RNA测序，鉴定出RNA结合蛋白半胱氨酸和甘氨酸丰富蛋白1（CSRP1）的上调，其调节肌球蛋白X（MYO10）外显子19的可变剪接，进而下调MYO10的表达，最终诱导血管内皮细胞形态球形化。使用CSRP1特异性shRNA敲低CSRP1或使用剪接抑制剂，球形化的血管内皮细胞恢复为扁平状态，表明Tp0136通过CSRP1调节MYO10的可变剪接，导致MYO10下调，随后血管内皮细胞球形化和细胞间连接增宽。这些发现有助于阐明梅毒螺旋体播散的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Tp0136蛋白是否通过干扰肌球蛋白合成诱导血管内皮细胞形态改变和细胞间连接增宽，从而增强血管通透性并促进梅毒螺旋体播散？
- 核心机制
- Tp0136上调CSRP1，进而促进MYO10外显子19的跳跃剪接，导致MYO10蛋白表达下调，诱导血管内皮细胞球形化和细胞间连接增宽，增强血管通透性。
- 主要证据
- 体内兔梅毒模型显示Tp0136诱导内皮细胞球形化和细胞间间隙延迟关闭；体外3D微流体系统显示Tp0136降低细胞覆盖率、增加细胞厚度和通透性；RNA-seq和RIP证实CSRP1结合MYO10 mRNA并调节其剪接；shRNA敲低CSRP1或SSA抑制剪接可逆转这些表型。
- 研究意义
- 本研究首次揭示梅毒螺旋体利用宿主RNA剪接机制操纵细胞骨架动力学，为理解细菌播散机制提供新视角，并提出将CSRP1/MYO10轴作为限制梅毒螺旋体播散的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外3D微流体血管模型功能验证
在体外模拟血管结构中评估Tp0136对HMEC-1细胞形态、排列和血管通透性的影响
HMEC-1细胞接种于3D微流体血管系统，培养4天形成稳定单层后，用不同浓度Tp0136蛋白（0、5、10 μg）处理6小时，PBS为对照。通过共聚焦显微镜观察细胞覆盖率、细胞厚度、细胞宽度和细胞间间隙，并用TRITC-葡聚糖检测通透性。
转录组测序和差异基因分析
鉴定Tp0136处理后差异表达的基因和相关信号通路
HMEC-1细胞用10 μg Tp0136蛋白或PBS处理6小时，提取RNA进行高通量转录组测序。分析差异表达基因（P<0.001）并进行GO富集分析，重点关注RNA结合蛋白和细胞形态维持相关基因。
RBPs筛选和CSRP1验证
从差异表达的RNA结合蛋白中筛选与细胞形态维持相关的关键分子
基于RNA-seq数据，筛选出146个差异表达RBPs（P<0.001，fold change≥1.5），其中9个与细胞形态维持相关。通过qPCR验证表达变化，CSRP1上调最显著（fold change=2.27），并通过Western blot确认蛋白水平随时间增加。
CSRP1敲低功能验证
验证CSRP1在Tp0136诱导的细胞形态改变和通透性增加中的功能必要性
使用CSRP1特异性shRNA构建sh-CSRP1 HMEC-1细胞系，对照为sh-Ctl。在3D微流体系统中，用Tp0136蛋白处理4天（PBS对照），通过鬼笔环肽染色观察细胞形态，并检测细胞覆盖率和通透性。
剪接事件和MYO10靶点鉴定
鉴定受CSRP1调控的可变剪接事件，并确定参与细胞形态调控的靶基因
从RNA-seq数据中分析外显子跳跃事件，获得881个CSRP1富集的基因。结合差异表达基因，192个基因下调且与细胞骨架相关，经GO和Sankey分析，MYO10被确定为关键靶点。RNA-蛋白免疫沉淀（RIP）验证CSRP1蛋白与MYO10 mRNA结合，MISO分析确定剪接位点为外显子19。
MYO10剪接和表达验证
验证Tp0136通过CSRP1调节MYO10外显子19的剪接，并影响MYO10蛋白表达
通过RT-PCR检测MYO10外显子19的剪接变异体比例，随着Tp0136处理时间延长，包含外显子19的变异体比例从接近100%下降至50%，跳过的变异体比例上升。Western blot检测MYO10蛋白水平随时间下降。在sh-CSRP1细胞中，MYO10剪接和表达恢复。
剪接抑制剂SSA回复实验
验证抑制MYO10剪接能否逆转Tp0136诱导的表型变化
在HMEC-1细胞中，使用剪接抑制剂SSA（100 ng/mL）处理6小时，观察MYO10剪接、蛋白表达、细胞形态和通透性。SSA处理抑制了Tp0136诱导的MYO10外显子19跳跃，细胞形态和通透性恢复到对照水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 重组蛋白制备 | pEXP-5-CT-TOPO载体 | -- | -- |
| 大肠杆菌BL21 | -- | -- | |
| 异丙基-B-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| 溶菌酶 | Solarbio | -- | |
| 尿素 | -- | -- | |
| Tris-HCl | -- | -- | |
| 鲎试剂 | Bioendo | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Takara Bio, Inc. | -- | |
| 电镜样本制备 | 硫代卡巴肼 | -- | -- |
| 醋酸铀 | -- | -- | |
| Walton氏天冬氨酸铅 | -- | -- | |
| 环氧丙烷 | -- | -- | |
| Durcupan树脂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞培养 | HMEC-1细胞专用培养基 | Procell Life Science & Technology | -- |
| 表达靶向人CSRP1 shRNA的慢病毒 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 剪接抑制素A | -- | HY-16466 | |
| 免疫细胞化学 | 胎牛血清 | -- | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| MYO10一抗 | Santa Cruz | -- | |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | Thermo Fisher | -- | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| 3D微流体血管生成系统 | TRITC-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 鬼笔环肽-iFluor 555试剂 | Abcam | -- | |
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片液 | Beyotime | -- | |
| LSM780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 细胞计数 | 含0.05% EDTA的胰酶 | -- | -- |
| CD31-FITC | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNA-seq数据分析 | FastQC | -- | -- |
| STAR软件 | -- | -- | |
| RStudio | -- | -- | |
| 可变剪接分析 | TopHat | -- | -- |
| rMATS | -- | -- | |
| Western blot | 凝胶记录系统 | Bio-Rad | -- |
| iBright CL750成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA-蛋白免疫沉淀 | RIP裂解缓冲液 | Merck Millipore | -- |
| 蛋白A/G磁珠 | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | -- |
| 数据分析 | DAVID数据库 | -- | -- |
| RPISeq数据库 | -- | -- | |
| Panther | -- | -- | |
| Enrichr | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内兔梅毒模型 | Tp0136蛋白接种剂量（10 μg）、接种频率（每三天）、感染时间（第18天开始）、取材时间（第36天、第42天） 阅读提示：见 Results 第2.1节和 Figure 1A |
| 3D微流体血管生成系统 | HMEC-1细胞接种密度（2×10^7 cells/mL）、培养时间（10天）、Tp0136处理浓度（0、5、10 μg）、处理时间（6小时） 阅读提示：见 Experimental Section 的“3D Microfluidic Angiogenesis System”部分 |
| CSRP1敲低实验 | shRNA序列、慢病毒感染滴度、嘌呤霉素筛选浓度和时间（4天） 阅读提示：见 Experimental Section 的“Cell Culture”部分 |
| 剪接抑制实验 | SSA浓度（100 ng/mL）、处理时间（6小时）、添加方式 阅读提示：见 Experimental Section 的“Cell Culture”部分和 Results 第2.4节 |
| RNA-seq和剪接分析 | Tp0136处理浓度（10 μg）、处理时间（6小时）、RNA提取方法、测序平台、数据分析参数（P<0.001, fold change≥1.5） 阅读提示：见 Experimental Section 的“RNA-Sequencing Data Analysis and Visualization”部分 |