FA对卵巢癌细胞活力的影响及IC50测定
评估不同浓度FA对卵巢癌细胞活力的抑制作用,并确定FA的IC50。
将SK-OV-3和OVCAR3细胞以3000细胞/孔接种于96孔板,用不同浓度FA(0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 μg/mL)处理24小时,然后通过CCK-8法测定细胞活力。
Fulvic acid exhibits antitumor effects in ovarian cancer cells by upregulating cytochrome P450 family 1 subfamily A member 1 expression.
包含体外细胞实验(CCK-8、Transwell)、RNA测序及qRT-PCR、Western blot验证,并进行CYP1A1过表达和敲低的功能验证,但缺乏动物实验和临床样本,整体属于中等水平。
SK-OV-3人卵巢癌细胞系 OVCAR3人卵巢癌细胞系
不同浓度FA(0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 μg/mL)处理卵巢癌细胞24h确定IC50 100 μg/mL FA处理卵巢癌细胞,评估对增殖、迁移和侵袭的影响 CYP1A1过表达和siRNA敲低实验,验证CYP1A1功能 FA处理SK-OV-3细胞48h后,进行Illumina RNA测序分析
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估不同浓度FA对卵巢癌细胞活力的抑制作用,并确定FA的IC50。
将SK-OV-3和OVCAR3细胞以3000细胞/孔接种于96孔板,用不同浓度FA(0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 μg/mL)处理24小时,然后通过CCK-8法测定细胞活力。
验证FA对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。
用100 μg/mL FA处理SK-OV-3和OVCAR3细胞,在24、48、72小时通过CCK-8法检测细胞增殖;通过Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。
揭示FA处理卵巢癌细胞后转录组的变化,寻找关键差异表达基因。
用100 μg/mL FA处理SK-OV-3细胞48小时,进行Illumina RNA测序,分析差异表达mRNA,区分上调(117个)和下调(342个)基因。
验证RNA测序结果的准确性,并确认FA对CYP1A1等基因表达的影响。
使用qRT-PCR检测FA处理后OVCAR3和SK-OV-3细胞中CYP1A1、SECTM1、SH3BGR、KRT81、ANKRD1和OLFML3的表达水平。
验证CYP1A1单独过表达是否能够模拟FA的抗肿瘤效应,从而证明CYP1A1是关键靶点。
用CYP1A1过表达质粒(CYP1A1-OE)转染OVCAR3和SK-OV-3细胞,分别用CCK-8法检测细胞增殖,用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。
通过沉默CYP1A1观察FA效应是否减弱,从而验证FA的作用依赖于CYP1A1。
在FA处理的OVCAR3和SK-OV-3细胞中,使用siCYP1A1敲低CYP1A1,然后通过CCK-8法检测细胞增殖,通过Transwell实验检测迁移和侵袭。
确认CYP1A1在过表达和敲低实验中的蛋白水平变化。
分别提取各组细胞总蛋白,用SDS-PAGE分离,转移至PVDF膜,孵育CYP1A1抗体和GAPDH抗体,检测蛋白表达水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Corning | 35-081-CV | |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 药物处理 | 黄腐酸(FA) | Nongda Fertilizer Company | C176008 |
| 细胞增殖检测 | 细胞增殖检测试剂盒 | Dojindo | CK04 |
| 细胞迁移侵袭实验 | Transwell小室 | Corning Costar | CLS3422 |
| 细胞侵袭实验 | 基质胶 | Corning | 354230 |
| 细胞迁移侵袭实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668030 |
| 基因敲低 | 靶向CYP1A1的小干扰RNA | RiboBio | stB0001414A |
| 对照siRNA | 阴性对照siRNA | RiboBio | siN0000001-1-5 |
| 基因过表达 | pcDNA3.1质粒 | -- | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596026CN |
| cDNA合成 | EasyScript第一链cDNA合成预混试剂 | TransGen Biotech | AE301-02 |
| qRT-PCR | AceQ qPCR SYBR Green预混试剂 | Vazyme | Q111-02 |
| Western blotting | PVDF膜 | Roche | 03010040001 |
| CYP1A1抗体 | Abcam | ab126887 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab157156 | |
| HRP标记的兔抗山羊IgG二抗 | Southern Biotech | 6020-05 | |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Scientific | 34577 | |
| 酶标仪 | Multiskan MK3酶标仪 | Thermo Scientific | -- |
| RNA测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与FA处理 | 细胞系来源、FA浓度(100 μg/mL)、处理时间(24-72小时)、FA纯度(>95%)和溶剂(PBS) 阅读提示:见Materials and methods中的Cells and FA、Groups和图2图例 |
| CCK-8增殖检测 | 细胞接种密度(3000 cells/well)、FA浓度系列、处理时间(24h用于IC50,24-72h用于增殖)、CCK-8试剂(CK04)和孵育时间(2h) 阅读提示:见Materials and methods中的Cell counting kit-8 assay图1和图2图例 |
| Transwell迁移和侵袭 | 细胞数量(3×10^4)、上室体积(200 μL)、下室血清浓度(10% FBS)、Incubation时间(24h)、Transwell小室型号(CLS3422)和Matrigel基质胶型号(354230) 阅读提示:见Materials and methods中的Transwell migration and invasion assays和图2图例 |
| RNA-seq差异基因分析 | SK-OV-3细胞数量(1×10^6)、FA浓度(100 μg/mL)、处理时间(48h)、测序平台(Illumina NovaSeq 6000)、差异基因筛选标准(fold change≥2) 阅读提示:见Materials and methods中的Illumina RNA sequencing and differentially expressed gene analysis和图3图例 |
| qRT-PCR验证 | 总RNA提取试剂(Trizol)、cDNA合成试剂盒(EasyScript SuperMix)、qPCR试剂(AceQ SYBR Green)、内参(18S rRNA)和引物序列 阅读提示:见Materials and methods中的Fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction和表1 |
| CYP1A1过表达和敲低 | 转染试剂(Lipofectamine 2000)、质粒DNA用量(100ng/孔96孔板, 500ng/孔24孔板, 2500ng/孔6孔板)、siRNA浓度(50 nM)和分组(pcDNA, CYP1A1-OE, FA+siNC, FA+siCYP1A1) 阅读提示:见Materials and methods中的Small interfering RNA and overexpressing plasmid和Groups |
| Western blotting | 蛋白上样量(30 μg)、一抗稀释浓度(CYP1A1 1:500,GAPDH 1:2000)、二抗稀释浓度(1:5000)和化学发光底物 阅读提示:见Materials and methods中的Western blotting和图4图例 |