黄腐酸通过上调细胞色素P450家族1亚家族A成员1表达在卵巢癌细胞中表现出抗肿瘤作用

Fulvic acid exhibits antitumor effects in ovarian cancer cells by upregulating cytochrome P450 family 1 subfamily A member 1 expression.

作者信息Min Chen, Ming Cheng, Chenchen Shao, Wenwen Liang, Yi Tang, Fangjun Ding
PMID40221570
发布时间2025-04-12
DOI10.1007/s12672-025-02236-5

实验完整度

包含体外细胞实验(CCK-8、Transwell)、RNA测序及qRT-PCR、Western blot验证,并进行CYP1A1过表达和敲低的功能验证,但缺乏动物实验和临床样本,整体属于中等水平。

主要模型

SK-OV-3人卵巢癌细胞系 OVCAR3人卵巢癌细胞系

重点核对

不同浓度FA(0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 μg/mL)处理卵巢癌细胞24h确定IC50 100 μg/mL FA处理卵巢癌细胞,评估对增殖、迁移和侵袭的影响 CYP1A1过表达和siRNA敲低实验,验证CYP1A1功能 FA处理SK-OV-3细胞48h后,进行Illumina RNA测序分析

摘要

目的:黄腐酸(FA)是一种腐殖质,在农业(畜牧业)和制药工业中有多种应用。然而,据我们所知,其抗肿瘤作用仍不清楚。本研究旨在阐明FA在卵巢癌细胞中的作用及其潜在机制。方法:为确定FA的半抑制浓度(IC50),将SK-OV-3和OVCAR3卵巢癌细胞暴露于不同浓度的FA中。通过CCK-8法和Transwell迁移和侵袭实验评估FA和细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。通过Illumina RNA测序鉴定差异表达的信使RNA,并用荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)验证。通过蛋白质印迹法测量CYP1A1蛋白水平。结果:FA对OVCAR3和SK-OV-3细胞的IC50值分别为689.9和752.0 μg/ml。FA处理抑制细胞增殖、侵袭和迁移。经Illumina RNA测序鉴定,FA处理的SK-OV-3细胞中,117个mRNA上调,342个mRNA下调。qRT-PCR结果显示,FA上调了两种细胞系中CYP1A1的表达。CYP1A1过表达模拟了FA处理对细胞增殖、侵袭和迁移的影响。此外,CYP1A1敲低减轻了FA处理诱导的这些效应。结论:FA抑制了SK-OV-3和OVCAR3细胞的增殖、侵袭和迁移,并上调了CYP1A1的表达。我们的结果表明,FA通过CYP1A1调控在卵巢癌细胞中发挥抗肿瘤作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
FA对卵巢癌细胞是否具有抗肿瘤作用,以及其潜在的分子机制是什么?
核心机制
FA通过上调CYP1A1表达来抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
主要证据
FA处理抑制了SK-OV-3和OVCAR3细胞的增殖、迁移和侵袭;FA处理上调了CYP1A1表达;CYP1A1过表达模拟了FA的效应,而CYP1A1敲低则减轻了FA的效应。
研究意义
本研究首次记录了FA在卵巢癌中的抗肿瘤作用,为将FA作为卵巢肿瘤潜在治疗药物提供了关键的实验基础,并提示CYP1A1可能作为卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

FA对卵巢癌细胞活力的影响及IC50测定

评估不同浓度FA对卵巢癌细胞活力的抑制作用,并确定FA的IC50。

将SK-OV-3和OVCAR3细胞以3000细胞/孔接种于96孔板,用不同浓度FA(0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 μg/mL)处理24小时,然后通过CCK-8法测定细胞活力。

2

FA对细胞增殖、迁移和侵袭的影响

验证FA对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。

用100 μg/mL FA处理SK-OV-3和OVCAR3细胞,在24、48、72小时通过CCK-8法检测细胞增殖;通过Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。

3

RNA测序及差异表达mRNA鉴定

揭示FA处理卵巢癌细胞后转录组的变化,寻找关键差异表达基因。

用100 μg/mL FA处理SK-OV-3细胞48小时,进行Illumina RNA测序,分析差异表达mRNA,区分上调(117个)和下调(342个)基因。

4

qRT-PCR验证差异表达基因

验证RNA测序结果的准确性,并确认FA对CYP1A1等基因表达的影响。

使用qRT-PCR检测FA处理后OVCAR3和SK-OV-3细胞中CYP1A1、SECTM1、SH3BGR、KRT81、ANKRD1和OLFML3的表达水平。

5

CYP1A1过表达对细胞功能的影响

验证CYP1A1单独过表达是否能够模拟FA的抗肿瘤效应,从而证明CYP1A1是关键靶点。

用CYP1A1过表达质粒(CYP1A1-OE)转染OVCAR3和SK-OV-3细胞,分别用CCK-8法检测细胞增殖,用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。

6

CYP1A1敲低对FA效应的影响

通过沉默CYP1A1观察FA效应是否减弱,从而验证FA的作用依赖于CYP1A1。

在FA处理的OVCAR3和SK-OV-3细胞中,使用siCYP1A1敲低CYP1A1,然后通过CCK-8法检测细胞增殖,通过Transwell实验检测迁移和侵袭。

7

Western blot验证CYP1A1蛋白表达

确认CYP1A1在过表达和敲低实验中的蛋白水平变化。

分别提取各组细胞总蛋白,用SDS-PAGE分离,转移至PVDF膜,孵育CYP1A1抗体和GAPDH抗体,检测蛋白表达水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基----
胎牛血清Corning35-081-CV
磷酸盐缓冲液----
黄腐酸(FA)Nongda Fertilizer CompanyC176008
细胞增殖检测试剂盒DojindoCK04
Transwell小室Corning CostarCLS3422
基质胶Corning354230
结晶紫----
Lipofectamine 2000转染试剂Invitrogen11668030
靶向CYP1A1的小干扰RNARiboBiostB0001414A
阴性对照siRNARiboBiosiN0000001-1-5
pcDNA3.1质粒----
Trizol试剂Invitrogen15596026CN
EasyScript第一链cDNA合成预混试剂TransGen BiotechAE301-02
AceQ qPCR SYBR Green预混试剂VazymeQ111-02
PVDF膜Roche03010040001
CYP1A1抗体Abcamab126887
GAPDH抗体Abcamab157156
HRP标记的兔抗山羊IgG二抗Southern Biotech6020-05
SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物Thermo Scientific34577
Multiskan MK3酶标仪Thermo Scientific--
Illumina NovaSeq 6000测序平台Illumina--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与FA处理
细胞系来源、FA浓度(100 μg/mL)、处理时间(24-72小时)、FA纯度(>95%)和溶剂(PBS)
阅读提示:见Materials and methods中的Cells and FA、Groups和图2图例
CCK-8增殖检测
细胞接种密度(3000 cells/well)、FA浓度系列、处理时间(24h用于IC50,24-72h用于增殖)、CCK-8试剂(CK04)和孵育时间(2h)
阅读提示:见Materials and methods中的Cell counting kit-8 assay图1和图2图例
Transwell迁移和侵袭
细胞数量(3×10^4)、上室体积(200 μL)、下室血清浓度(10% FBS)、Incubation时间(24h)、Transwell小室型号(CLS3422)和Matrigel基质胶型号(354230)
阅读提示:见Materials and methods中的Transwell migration and invasion assays和图2图例
RNA-seq差异基因分析
SK-OV-3细胞数量(1×10^6)、FA浓度(100 μg/mL)、处理时间(48h)、测序平台(Illumina NovaSeq 6000)、差异基因筛选标准(fold change≥2)
阅读提示:见Materials and methods中的Illumina RNA sequencing and differentially expressed gene analysis和图3图例
qRT-PCR验证
总RNA提取试剂(Trizol)、cDNA合成试剂盒(EasyScript SuperMix)、qPCR试剂(AceQ SYBR Green)、内参(18S rRNA)和引物序列
阅读提示:见Materials and methods中的Fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction和表1
CYP1A1过表达和敲低
转染试剂(Lipofectamine 2000)、质粒DNA用量(100ng/孔96孔板, 500ng/孔24孔板, 2500ng/孔6孔板)、siRNA浓度(50 nM)和分组(pcDNA, CYP1A1-OE, FA+siNC, FA+siCYP1A1)
阅读提示:见Materials and methods中的Small interfering RNA and overexpressing plasmid和Groups
Western blotting
蛋白上样量(30 μg)、一抗稀释浓度(CYP1A1 1:500,GAPDH 1:2000)、二抗稀释浓度(1:5000)和化学发光底物
阅读提示:见Materials and methods中的Western blotting和图4图例