基于TCGA数据库筛选DEGs及功能富集分析
识别HCC肿瘤和癌旁组织之间的差异表达基因，并探索其生物学功能。
从TCGA数据库下载368例HCC肿瘤样本和50例癌旁样本的表达矩阵，使用limma包筛选DEGs（P adj.<0.01且|logFC|>2），并进行GO和KEGG富集分析。
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PBK作为新的生物标志物在HCC中表现出优异的诊断和预后价值，并与免疫浸润和甲基化相关。
PBK as a novel biomarker performed excellent diagnostic and prognostic value in HCC associated with immune infiltration and methylation.
实验完整度
中包含基于TCGA和GEO数据的生物信息学分析、临床样本验证以及体外细胞功能实验（沉默PBK后检测增殖、迁移等），但缺乏体内动物实验和更深入的机制研究。
主要模型
HCC细胞系（HepG2和Huh-7） HCC患者样本（31例） TCGA HCC队列（368例肿瘤样本）
重点核对
PBK表达水平（通过qRT-PCR和Western blot验证） 细胞增殖、迁移和侵袭能力（CCK-8、集落形成、Transwell实验） PBK甲基化位点（cg17973772和cg21887430） 免疫细胞浸润相关性（ssGSEA分析）
摘要
肝细胞癌（HCC）的诊断和预后在临床中仍是主要挑战。本研究旨在探索用于HCC诊断和预后预测的基因特征，并进一步探究其机制。使用TCGA筛选HCC中的差异表达基因（DEGs）。通过特定公式计算与预后相关的DEGs的临床特征，获得特定模型，并进行Kaplan-Meier分析。使用STRING预测蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），并使用R软件分析hub基因与临床特征之间的关联。在HCC细胞系中沉默hub基因，随后进行细胞行为分析。本研究确定了一个与预后相关的14基因模型，该模型能显著将样本分为高风险组和低风险组。PBK、BUB1、NUF2和CDCA8是14基因编码的PPI中的关键节点，具有高诊断价值，且仅PBK是HCC疾病特异性生存（DSS）的独立危险因素。此外，较高的PBK与HCC的病理和组织学分级、较高的AFP以及Th2、T辅助细胞和aDC的浸润呈正相关，但与杀伤性免疫细胞呈负相关。甲基化失调可能有助于PBK的高表达，沉默PBK显著抑制了HCC细胞的增殖、生长、迁移和侵袭。PBK、BUB1、NUF2和CDCA8在具有高诊断价值的预后相关14基因模型中发挥关键作用。甲基化失调诱导的PBK积聚可能通过调节免疫监视促进HCC的发展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索用于HCC诊断和预后预测的基因特征，并阐明其潜在机制。
- 核心机制
- PBK表达上调可能由甲基化失调导致，并通过调节免疫监视（与Th2、T辅助细胞和aDC正相关，与杀伤性免疫细胞负相关）促进HCC进展。
- 主要证据
- 基于TCGA和GEO数据构建14基因模型，发现PBK、BUB1、NUF2、CDCA8为关键节点；体外实验显示沉默PBK抑制HepG2和Huh-7细胞增殖、迁移和侵袭。
- 研究意义
- 该研究为HCC的诊断和预后预测提供了新的潜在生物标志物，并强调了PBK在HCC进展中的关键作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建预后相关基因模型并验证
基于临床特征构建预后模型，并验证其预测能力。
对419个上调DEGs进行单因素Cox回归分析（P<0.000119），筛选出45个预后相关基因，进一步用LASSO算法构建14基因预后模型。根据特征值中位数将样本分为高低风险组，进行K-M分析，并使用GEO数据集（GSE54236和GSE76427）进行外部验证。
PPI网络构建及hub基因筛选
分析14基因编码蛋白的相互作用，并识别关键hub基因。
使用STRING数据库构建PPI网络（阈值≥0.9），并用Cytoscape可视化。通过GO-BP富集分析发现关键节点。
hub基因表达、诊断及预后价值评估
评估hub基因（PBK、CDCA8、BUB1、NUF2）在HCC中的表达水平及诊断和预后价值。
提取hub基因在TCGA中的表达数据，分析其与正常组织的差异；绘制ROC曲线评估诊断价值（AUC>0.96）；进行K-M生存分析评估预后价值，并使用Cox回归分析确定独立风险因素。
PBK与临床特征及免疫浸润的相关性分析
探索PBK表达与临床病理特征和免疫细胞浸润的关系。
使用ANOVA分析PBK表达与临床特征（年龄、性别、T分期等）的相关性；使用ssGSEA评估PBK与24种免疫细胞浸润的相关性。
PBK甲基化预测及生存关联分析
探讨PBK甲基化状态与预后的关系。
使用MethSurv预测PBK甲基化位点，并用Kaplan-Meier分析两个显著甲基化位点（cg17973772和cg21887430）与生存的关系；同时分析PBK表达与甲基化相关基因（如RBMX和IGF2BP3）的相关性。
临床样本验证PBK表达
在独立临床样本中验证PBK在HCC中的表达上调。
收集31例HCC和配对癌旁组织，通过qRT-PCR检测PBK相对表达量。
细胞实验验证PBK功能
评估沉默PBK对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
在HepG2和Huh-7细胞中通过慢病毒感染敲低PBK，使用CCK-8和集落形成实验检测增殖，Transwell实验检测迁移和侵袭能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
转录组差异分析和功能富集
预后模型构建和验证
蛋白质相互作用网络分析
诊断和预后价值评估
免疫浸润分析
基因表达验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Basal Media | -- |
| 胎牛血清 | Basal Media | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | BIO Basic lnc | -- | |
| 慢病毒包装和感染 | 脂质体转染试剂2000 | Invitrogen | -- |
| 0.45 μm滤器 | Millipore | -- | |
| 细胞增殖实验 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | -- |
| 酶标仪 | Thermo | -- | |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Sangon | -- |
| Transwell实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| 倒置显微镜 | Olympus | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| M-MLV反转录酶试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| ABI 7500实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量法 | Pierce | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗PBK抗体 (#ab280209) | Abcam | #ab280209 | |
| 抗GAPDH抗体 (#ab8245) | Abcam | #ab8245 | |
| 兔抗鼠二抗 (#ab6728) | Abcam | #ab6728 | |
| 增强化学发光（ECL）法 | Pierce | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DEGs筛选 | TCGA样本筛选条件：368例HCC和50例癌旁；DEGs阈值：P adj.<0.01, |logFC|>2。 阅读提示：见Materials and methods部分'Data source and screening'和'Analysis of differentially expressed genes (DEGs)' |
| 预后模型构建 | 单因素Cox回归P<0.000119；LASSO算法筛选14个基因；特征值中位数5.752用于分组。 阅读提示：见Materials and methods部分'Screening of prognosis associated genes in HCC and model construction' |
| PPI网络分析 | STRING数据库版本9.1；交互分数阈值≥0.9。 阅读提示：见Materials and methods部分'Construction of protein–protein interaction network and functional enrichment' |
| 免疫浸润分析 | 使用ssGSEA算法，来自GSVA包；PBK与免疫细胞浸润的相关性。 阅读提示：见Materials and methods部分'Correlations between gene expression and clinical features...'和Results部分'High PBK1 expression was correlated with the adverse clinical features and immune infiltrations of HCC' |
| 甲基化分析 | MethSurv预测的甲基化位点cg17973772和cg21887430。 阅读提示：见Materials and methods部分'Methylation prediction and outcome association analysis' |
| 临床样本验证 | 31例HCC和配对癌旁组织；纳入标准和排除标准。 阅读提示：见Materials and methods部分'Clinical samples collection and detection' |
| 细胞培养 | 细胞系：HepG2、Huh-7；培养条件：DMEM+10%FBS+1%青霉素-链霉素，37°C，5%CO2。 阅读提示：见Materials and methods部分'Cell culture and lentivirus infection' |
| 细胞功能实验 | CCK-8：细胞密度1.0×10^4/孔，检测0、24、48、72小时；集落形成：3.0×10^3/皿，培养14天；Transwell：1×10^4细胞/孔，培养48小时。 阅读提示：见Materials and methods部分'Cell proliferation assay'和'Transwell assay' |